基因工程原理與技術(shù)-植物基因工程

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1、植物基因工程1983年，首次獲得轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草現(xiàn)在，已獲得200多種植物的轉(zhuǎn)基因植株。第一節(jié)農(nóng)桿菌及其轉(zhuǎn)化體系一、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciences)的生物學(xué)特征1、形態(tài)細(xì)胞呈桿狀，大小為0.8um×1.5~3.0um，1~4根周生鞭毛，菌落無色、光滑。2、生長條件最適溫度：25~30℃，28℃培養(yǎng)；最適pH：6.0~9.03、宿主植物雙子葉植物、裸子植物4、侵染宿主的癥狀及原因冠癭瘤，Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)的T-DNA。T-D

2、NA是指農(nóng)桿菌質(zhì)粒上一段能轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的DNA片段。二、Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和功能1、Ti質(zhì)粒的類型與分區(qū)環(huán)狀雙鏈DNA分子，140~235kb。根據(jù)其誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生冠癭堿的種類，分為章魚堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型、農(nóng)桿菌素堿型(琥珀堿型)。功能區(qū)毒性區(qū)(Vir區(qū))T-DNA區(qū)接合轉(zhuǎn)移區(qū)復(fù)制起始區(qū)章魚堿型2、T-DNA的結(jié)構(gòu)與功能邊界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC右邊界序列是完全保守的，對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)移是必須的。T-DNA的編碼基因3、Vir區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能

3、30~40kb，有virA~virM等操縱子。virA操縱子：組成型，長約為2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是內(nèi)膜受體蛋白，感應(yīng)并結(jié)合酚類化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一種自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。virG操縱子：組成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)為轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)其他vir基因的表達(dá)。virB操縱子：誘導(dǎo)型，virB1~virB11基因。VirB蛋白構(gòu)成跨膜復(fù)合體(T-鏈復(fù)合體運(yùn)輸器)供T-DNA越膜轉(zhuǎn)移。virC操縱子：誘導(dǎo)型，virC1

4、、virC2基因。VirC1蛋白與超驅(qū)動(dòng)序列(離右邊界外側(cè)17bp處的一個(gè)24bp的保守序列)結(jié)合，促進(jìn)T-DNA加工。virD操縱子：誘導(dǎo)型，virD1~virD4基因。VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白參與T-DNA加工形成T-鏈：首先VirD1與25bp邊界序列親和結(jié)合，使其松弛，然后使VirD2在特異位點(diǎn)剪切。VirD2與T-鏈的5’端共價(jià)結(jié)合，并核定位信號(hào)，將T-鏈復(fù)合體導(dǎo)向細(xì)胞核。virE操縱子：誘導(dǎo)型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssD

5、NA結(jié)合蛋白，與T-鏈結(jié)合，參與T-鏈復(fù)合體形成，還具有核定位信號(hào)，引導(dǎo)T-鏈復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞核。virF操縱子：誘導(dǎo)型，virF基因。VirF蛋白(23kD)參與T-鏈復(fù)合體的運(yùn)輸。virH操縱子：誘導(dǎo)型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物傷口細(xì)胞產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)。三、T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的機(jī)理(農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機(jī)理)①植物創(chuàng)傷反應(yīng)與農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的識(shí)別和附著；②信號(hào)分子的釋放積累與VirA蛋白的感應(yīng)；③VirG蛋白激活與vir基因的誘導(dǎo)表達(dá)；④T-鏈復(fù)合體的形成；T-

6、鏈?zhǔn)侵竩ir基因被誘導(dǎo)表達(dá)后加工T-DNA而產(chǎn)生的單鏈T-DNA。T-鏈復(fù)合體是指結(jié)合了VirD2、VirE2蛋白的T-鏈。⑤T-鏈復(fù)合體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；通過T-鏈復(fù)合體運(yùn)輸器和T菌毛進(jìn)入植物細(xì)胞。⑥T-DNA整合到植物染色體上。四、Ti質(zhì)粒的改造與轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建野生型Ti質(zhì)粒不能直接作為植物轉(zhuǎn)化載體：①Ti質(zhì)粒分子過大，沒有單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，基因操作困難，不能直接將外源基因插入其T-DNA中；②T-DNA區(qū)的onc基因產(chǎn)物將干擾受體植物內(nèi)源激素的平衡，導(dǎo)致冠癭瘤的產(chǎn)生，阻礙細(xì)胞的分化和植株

7、的再生；現(xiàn)已通過中間載體途徑構(gòu)建許多植物轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，主要有共整合載體系統(tǒng)、雙元載體系統(tǒng)、隔端載體系統(tǒng)。1、共整合載體系統(tǒng)(cointegratevectorsystem)由卸甲Ti質(zhì)粒載體、中間表達(dá)載體組成。例如：pGV3850、pLGVneo1103AmprpLGVneo1103Cointegrateplasmid2、雙元載體系統(tǒng)(binaryvectorsystem)由微型質(zhì)粒、輔助Ti質(zhì)粒組成。例如：Bin19、pAL4404雙元載體系統(tǒng)比共整合載體系統(tǒng)更優(yōu)越：①插入外源基因的操作較簡單；

8、②轉(zhuǎn)化效率較高。lacZ’3、隔端載體系統(tǒng)與共整合載體系統(tǒng)一樣，由卸甲Ti質(zhì)粒載體和中間表達(dá)載體通過同源重組共整合成轉(zhuǎn)化載體，但與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的T-DNA左右邊界序列分別位于兩個(gè)載體上。共整合載體系統(tǒng)和隔端載體系統(tǒng)統(tǒng)稱為一元載體系統(tǒng)或順式載體系統(tǒng)。雙元載體系統(tǒng)也稱為反式載體系統(tǒng)。五、Ri質(zhì)粒載體系統(tǒng)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhiizogenes)Ri質(zhì)粒分為農(nóng)桿堿型、甘露堿型、黃瓜堿型Ri質(zhì)粒的Vir區(qū)與Ti質(zhì)粒的高度同源，T-DNA區(qū)的邊界序列與Ti質(zhì)粒的高度同源，