植物基因工程

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1、植物基因工程植物生物工程教研室第一章抗植物病蟲害基因及其應(yīng)用第一節(jié)抗植物蟲害基因及其應(yīng)用第二節(jié)抗植物病毒基因及其應(yīng)用第三節(jié)抗植物真菌病害基因及其應(yīng)用第四節(jié)抗植物細(xì)菌病害基因及其應(yīng)用第一節(jié)概述一、作用及意義二、抗性基因的來源三、抗性基因分類一、作用及意義應(yīng)用抗病蟲害基因具有以下優(yōu)勢(shì)：1.育種周期短、效率高、成本低。2.提高產(chǎn)量和品質(zhì)。3.降低生產(chǎn)成本。4.防止化學(xué)農(nóng)藥污染，避免破壞生態(tài)平衡。5.克服親本基因資源缺乏。6.抗性性狀具有連續(xù)性和整體性。二、抗性基因的來源根據(jù)基因來源分為三類：1.植物組織如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。2.動(dòng)物如殺菌肽（cecro

2、pins）基因。3.微生物如Bt殺蟲結(jié)晶蛋白基因。三、抗性基因分類據(jù)基因的作用功能和對(duì)象分為：1.抗蟲基因。2.抗病毒基因。3.抗真菌和細(xì)菌基因。第二節(jié)抗植物蟲害基因及其應(yīng)用一、Bt基因及其應(yīng)用二、蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用三、植物凝集素基因及其應(yīng)用四、淀粉酶抑制劑基因及其應(yīng)用一、Bt基因及其應(yīng)用Bt基因的作用原理2.ICP的分類、結(jié)構(gòu)及抗蟲譜Bt基因的應(yīng)用4.存在的問題及對(duì)策1.Bt基因的作用原理Bt基因：是從微生物蘇云金桿菌（Bacillusthu-ringicnsis）分離出的蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因，簡(jiǎn)稱Bt基因。蘇云金桿菌屬于革蘭氏陰性，形成

3、孢子細(xì)菌。在芽胞形成過程中，可產(chǎn)生伴胞晶體，它由一種或多種蛋白組成，具有高度特異性殺蟲活性，這種蛋白通常被稱作δ-內(nèi)毒素（δ-endotoxins）或殺蟲結(jié)晶蛋白（in-secticidalcrysta1protein，ICP）。作用原理：ICP通常以原毒素（protoxin）形式存在，當(dāng)昆蟲取食ICP后，原毒素在昆蟲的消化道內(nèi)被活化，轉(zhuǎn)型為毒性多肽分子?；罨腎CP與昆蟲腸道上皮細(xì)胞上的特異性結(jié)合蛋白結(jié)合，全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中，使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道，細(xì)胞因滲透平衡糟破壞而破裂。導(dǎo)致昆蟲幼蟲停止進(jìn)食，最終死亡。ICP的活化過程：首先ICP溶解在昆蟲

4、的腸道里（ICP在堿性條件可溶，而在中性條件下不溶），然后，在蛋白酶的作用下，通過專一性蛋白酶水解切割，ICP被活化?；罨腎CP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破壞。2．ICP的分類、結(jié)構(gòu)及抗蟲譜據(jù)抗蟲譜和序列同源性分為四種類型：類型I（CryI）抗鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲，對(duì)其幼蟲有特異的毒性作用。類型II（CryII）抗鱗翅目和雙翅目（Diptera）。類型III（CryIII）抗鞘翅目（Coleoptera）昆蟲。類型IVw（CryIV）抗雙翅目（Diptera）昆蟲。類型V（CryV）抗鱗翅目和鞘翅目。近年P(guān)ayne等人則發(fā)現(xiàn)了具有抗膜翅

5、目（Hymeno-ptera）以及抗線蟲（Nematodes）的ICP。在每種主要類型中，據(jù)序列同源性，ICP又劃分為若干亞類例如，CryI又分為IA(a)、IA(b)、IA(c)、IB、IC等。ICP的結(jié)構(gòu)CryＩ蛋白為長(zhǎng)1100～1200個(gè)氨基酸的多肽，大小為130～140kD，其毒性多肽分子是約60～70kD的核心片段。活性區(qū)在氨基端，而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列沒有毒性功能。只保留編碼毒性核心片段的核苷酸序列就能達(dá)到抗蟲目的。如，Bt2編碼的最短毒性片段位于29至607氨基酸殘基處，進(jìn)一步從基因3′端刪除4個(gè)密碼子（codon）或從5

6、′端刪除8個(gè)密碼子，將完全喪失產(chǎn)物的毒性功能。3.Bt基因的應(yīng)用1987年比利時(shí)的Vacek等人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株。他們使用全長(zhǎng)的CryIA（b）基因編碼1155個(gè)氨基酸和該基因保留了5ˊ端編碼毒蛋白核心區(qū)域的缺失片段（編碼610個(gè)氨基酸）。轉(zhuǎn)基因植株對(duì)煙草天蛾（ManducaSexta）幼蟲的抗性為75％～100％。美國(guó)Monsanto公司的Fischhoff等人（1987年）獲得轉(zhuǎn)Bt基因的番茄植株。他們用帶有CaMV35S啟動(dòng)子的CryIA(b)基因轉(zhuǎn)化番茄品系VF36。獲得了對(duì)煙草天蛾顯示出高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因植株。但因IC

7、P表達(dá)水平低，對(duì)番茄果螟（Heliothisvirescens）的抗性不強(qiáng)。目前全世界已有許多不同類型的ICP基因轉(zhuǎn)入多種作物，如煙草、番茄、玉米、棉花、水稻、蘋果、核桃等。研究結(jié)果表明：一般用全長(zhǎng)CryIA基因轉(zhuǎn)化植物，ICP在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量很低，甚至檢測(cè)不到，其抗蟲效果差或不具抗蟲性。在高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植株中，每毫克可溶性蛋白中約有2.6～190ng的ICP。4.存在的問題及對(duì)策（1）ICP在植物中表達(dá)水平低（2）昆蟲對(duì)ICP產(chǎn)生抗性（3）抗菌譜窄（1）ICP在植物中表達(dá)水平低原因：主要是mRNA不穩(wěn)定和翻譯效率低。天然的Bt基因富含A、T堿基

8、,而植物基因富含G、C堿基,可能導(dǎo)致Bt基因轉(zhuǎn)錄的末成熟終止（prematuretranscr