植物基因工程

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1、植物基因工程通過植物基因工程獲得轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展及植物分子生物學(xué)研究中有十分重要的意義，已獲得的有重大經(jīng)濟價值的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)很多。進行植物轉(zhuǎn)化的方法也在不斷創(chuàng)新。從目前看，大體上可分為三類：概述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以原生質(zhì)體或細胞（組織）作為受體的直接基因轉(zhuǎn)移，如：聚乙二醇法（PEG）電擊（EP，electroporation）脂質(zhì)體（Lip，Lome）磷酸鈣－DNA共沉淀（Ca－P）微注射（Mi，Microinjection）基因槍法（particlebombardment，簡稱PB）超聲波法（Ulstrasonication）種質(zhì)系統(tǒng)（germlinetranstormatio

2、n）的基因轉(zhuǎn)移，如利用子房注射、種胚以及花粉管通道等導(dǎo)入外源基因植物轉(zhuǎn)基因的主要方法在當(dāng)今眾多的植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)中，最為可靠和有效的方法之一是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這是一個本來就存在于自然界的“天然”的基因工程系統(tǒng)。隨著人們對其機理的揭示，使人們得以利用其進行植物的定向轉(zhuǎn)化―把有益基因轉(zhuǎn)入植物，成為可能。概述目前，人們對這一天然過程已有了較深入地了解，對其基因組織、結(jié)構(gòu)、遺傳功能，表達調(diào)控的研究不斷深入。其基因（T-DNA）的轉(zhuǎn)移，是一個極為復(fù)雜而又巧妙的生物學(xué)過程。它涉及到生物分子間識別、信息傳遞、蛋白質(zhì)激活、基因表達調(diào)控、生物大分子輸入轉(zhuǎn)移等一系列分子及細胞生物學(xué)過程，盡

3、管有很多問題還有待深入研究、而還有很多問題不斷出現(xiàn)，但利用它進行植物基因轉(zhuǎn)移已成為可能，并有很多成功的實例。概述植物基因工程1.根癌農(nóng)桿菌與植物轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)2.植物基因工程中Ti載體及其構(gòu)建3.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)4.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序5.植物病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化1.根癌農(nóng)桿菌與植物轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)1.1植物冠癭瘤－植物的一種癌癥1.2Ti質(zhì)粒1.3T－DNA1.4Vir區(qū)的基因結(jié)構(gòu)與功能1.5農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機理1.1植物冠癭瘤——植物的一種癌癥1.1冠癭瘤植物與人一樣，可以產(chǎn)生各種各樣的瘤和癌。其中一類瘤被叫作癭，癭的種類很多。引起癭的因素有：受傷、昆蟲、病毒、細菌和特定的基因組

4、織表達等。人們最感興趣的癭是冠癭瘤。1.1.1冠癭瘤的起因由根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）[屬根瘤菌科（Rhizobiaceat）]對植物的侵染而引起。1.1.2冠癭瘤的侵染過程細菌通過傷口進入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植物。細菌DNA中的編碼基因在植物細胞中表達，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。冠癭瘤上：電鏡下的根癌農(nóng)桿菌下：冠癭瘤1.1.3冠癭瘤的一般生物學(xué)特性45℃殺死侵染植物的根癌農(nóng)桿菌，植物組織仍然能形成癌。把瘤組織培養(yǎng)在不加生長素和細胞分裂素的培養(yǎng)基上，能夠無限止的分裂和生長。（1）根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞的能力是因為它含有一個叫作Ti（tumor-

5、inducing）的質(zhì)粒（Tiplasmid）。（2）根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生兩種物質(zhì)：類植物激素和冠癭堿。類植物激素使細胞大量擴增，出現(xiàn)冠癭瘤；冠癭堿是受侵染植物組織合成的稀有氨基酸，包括胭脂堿、章魚堿等。冠癭堿是根癌農(nóng)桿菌生活的C、N和能量來源。1.2Ti質(zhì)粒1.2.1Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D，約有200kb。最近有人發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌中還有其它的質(zhì)粒，稱之為隱秘質(zhì)粒。穩(wěn)秘質(zhì)粒的功能還不清楚，有的認(rèn)為可能是缺陷型的Ti質(zhì)粒。迄今已從多種植物中分離出不同種類的根癌農(nóng)桿菌。1.2Ti質(zhì)粒1.2.2Ti質(zhì)粒的物理圖譜物理圖譜

6、：限制性內(nèi)切酶酶切片段在Ti-DNA上的排列順序。Ti物理圖譜構(gòu)建：經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理之后的Ti質(zhì)粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳作片段分離，便可顯示出有20多條大小不同的DNA酶切片段。然后將這些酶切片段進行分子雜交分析，測定順序，再排列成完整的物理圖。1.2Ti質(zhì)粒1.2.3Ti質(zhì)粒的基因圖譜基因圖譜：基因在Ti-DNA上的排列順序?；驁D譜構(gòu)建：轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法利用細菌的轉(zhuǎn)座子（transposon），使Ti質(zhì)粒發(fā)生嵌入突變和缺失突變。細菌轉(zhuǎn)座子帶有各種抗菌素抗性的基因，在轉(zhuǎn)化過程中它們可嵌入Ti質(zhì)粒，使根癌農(nóng)桿菌帶有相應(yīng)的抗菌素抗性，因而可方便地篩選出轉(zhuǎn)座子嵌入Ti質(zhì)粒突變體。由于在轉(zhuǎn)座子嵌入

7、處的編碼基因發(fā)生失活，因而可通過分析Ti質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶片段的變化，如某些片段消失或電泳遷移率改變，確定這些基因插入位置，并且與突變體的表型相對應(yīng)，從而建立Ti質(zhì)粒的基因圖。目前已建立了十多個Ti質(zhì)粒的基因圖，其中主要是章魚堿型和胭脂堿型兩大類的Ti質(zhì)粒基因圖。1.2Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒的基因圖譜不同的Ti質(zhì)粒有二個同源區(qū)：①Vir區(qū)（轉(zhuǎn)化所必須）是毒性區(qū)，也叫毒性基因或Vir基因或致病基因。②T－DNA（tra