組織DNA與RNA的分離和提取.doc

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1、組織DNA與RNA的分離和提取一、實(shí)驗(yàn)材料1.器材手術(shù)器械、勻漿器、臺(tái)式微量高速離心機(jī)、微量加樣器、振蕩器、水浴鍋。2.試劑（1）0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA：稱NaCl8.18g、乙二胺四乙酸二鈉鹽3.72g，加蒸餾水溶解，調(diào)pH至7，稀釋至1000ml，貯放冰箱中；（2）25%SDS：稱取十二烷基硫酸鈉25g，溶于50%的乙醇中至100ml，室溫存放；（3）2mol/LNaCl：稱11.7gNaCl，用蒸餾水配置成100ml溶液；（4）氯仿-異戊醇：氯仿24份與異丙醇1份混勻；（5）80%酚：取苯酚80份，加蒸餾水20份，混勻后裝

2、棕色瓶中；（6）0.05mol/L醋酸緩沖溶液（pH5.0）：0.5mol/L醋酸鈉35ml，0.2mol/L醋酸15ml，加蒸餾水稀釋至1000ml，混勻后測(cè)pH應(yīng)為5.0；(7)2mol/L醋酸鈉：取無(wú)水醋酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解后配成100ml；（8）95%乙醇。二、實(shí)驗(yàn)操作1.組織DNA的分離提?。?）小鼠剪短頸動(dòng)脈，放血處死，開(kāi)腹取其脾及兩腎（約0.3g），浸入預(yù)冷至0℃的0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA中，洗去血液，剝?nèi)ブ車闹炯敖Y(jié)締組織，用濾紙吸干。（2）將組織剪碎，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，加入0.14mol/LNaCl-0

3、.01mol/LEDTA液7ml，旋轉(zhuǎn)上下勻漿，至絕大部分細(xì)胞破碎為止。（3）2500r/min離心15min，吸去上層液體，向沉淀中再加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA混勻，離心洗滌之（如欲獲得RNA含量極少的純DNA時(shí)，此步離心洗滌應(yīng)重復(fù)多次）。（4）經(jīng)洗滌后的沉淀，加入3ml0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA，在攪拌下緩緩滴入25%SDS0.4ml，轉(zhuǎn)入勻漿器內(nèi)混勻，使沉淀懸浮均勻，再加入2mol/L的NaCl4ml。此時(shí)，由于大部分脫氧核苷酸蛋白溶出，溶液粘度驟然升高，再勻漿一次使之均勻。（5）轉(zhuǎn)入三角瓶中，

4、加等溶劑的氯仿-異戊醇約8ml，劇烈振搖10min，3000g離心10min，上層為水液，下層為氯仿，中間界面為變性蛋白質(zhì)，吸出上清水液（如欲獲得摻雜蛋白質(zhì)較少的DNA，抽提和離心可重復(fù)多次，直至界面看不到變性蛋白質(zhì)層為止）。（6）上層水液邊搖邊加入等體積的95%乙醇，即可見(jiàn)有長(zhǎng)纖維線狀DNA析出，用玻棒攪拌，DNA及粘纏在玻棒上，瓶壁上盡量將水分?jǐn)D干。（7）纏在玻棒上的DNA纖維溶于1ml0.1mol/L溶液中，待定量和電泳分析。2.組織RNA的分離提?。?）饑餓一天的小鼠，放血處死，解剖出肝，浸于預(yù)冷至0℃的0.05mol/L的醋酸緩沖液（pH5.0）中，

5、剝?nèi)ジ伍T(mén)處的結(jié)締組織，洗去血液，用濾紙吸干。（2）取0.3g肝，加入0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.0）3ml、25%SDS0.5ml，移入勻漿管，勻漿后加入等體積80%酚，再勻漿一次。（3）移入三角瓶中，置65℃水浴中繼續(xù)振搖5~8min，取出后冷卻。（4）3000r/min離心10~15min，上層水相含有RNA稍渾濁，中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚液，管底殘?jiān)泻蠨NA。吸出上層水液（若要提高RNA的收獲量，可向中下層液中再加入1/2體積的醋酸緩沖液，重復(fù)65℃水浴振搖、離心步驟，合并兩次的上層水液）。（5）分別加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉、

6、2.5倍體積遇冷的95%乙醇，混勻，于冷處放置至絮狀沉淀充分形成。（6）3000r/min離心10min，棄上清，離心管倒置于濾紙片上，盡量使液體流干。（7）RNA沉淀用蒸餾水1ml溶解，待定量和電泳分析。三、注意事項(xiàng)1.DNA和RNA的提取操作應(yīng)在4℃進(jìn)行。2.手上有RNA酶，提取RNA時(shí)應(yīng)戴手套，盡量避免RNA酶污染。3.提取DNA時(shí)，需待纖維狀DNA大分子充分析出后，再用玻璃棒將其纏繞出來(lái)。Trizol法是利用RNA和DNA在溶液中分布不同將其分開(kāi)，RNA分布在水相中，DNA分布在有機(jī)相中，用乙醇將DNA沉淀下來(lái)。其它的DNA提取方法：酚抽提法、甲酰胺解

7、聚法、TRIzol法詳見(jiàn)《組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》第267頁(yè)