牛病毒性腹瀉病毒山東株的分離與鑒定

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1、牛病毒性腹瀉病毒山東株的分離與鑒定牛病毒性腹瀉病毒山東株的分離與鑒定摘要：牛病毒性腹瀉病毒是牛病毒性腹瀉-黏膜病的重要病原體，該病毒病是極為復(fù)雜、呈多臨床類(lèi)型表現(xiàn)的傳染病，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從疑似牛病毒性腹瀉-黏膜病的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，該病毒為牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒，TCID50測(cè)定該病毒的滴度為107.15TCID50/mlo該病毒株的分離鑒定為牛病毒性腹瀉病毒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒；分離

2、；鑒定中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2013)02-0041-04牛病毒性腹瀉-黏膜病(BovineViralDiarrhea-MucosalDisease,BVD-MD)是rh牛病毒性腹瀉病毒(BovineViralDiarrheavirus,BVDV)感染而引起的一種重要傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛、潰瘍、白細(xì)胞減少、持續(xù)感染與免疫耐受、免疫抑制、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸型胎以及致死性黏膜病為主耍特征［1,2］。該病呈世界性分布，廣泛存在于美國(guó)、澳大利亞、英國(guó)、新西蘭

3、、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等國(guó)家［3］oBVDV不僅可感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其它反芻動(dòng)物。1946年美國(guó)人Olafson等首次發(fā)現(xiàn)并分離出BVDV,1983年我國(guó)李佑民等首次從流產(chǎn)胎兒的脾臟中分離到BVDVoBVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae),瘟病毒屬(Pestivirus),與豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)和綿羊邊界病毒(BorderDiseaseVims,BDV)同屬，存在抗原相關(guān)性，在血清學(xué)上存在著交叉反應(yīng)，而且能夠突破彳首主特異性發(fā)生交叉

4、感染［4］。根據(jù)BVDV病毒基因組5,端非翻譯區(qū)⑸NTR)序列比較,把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-I)和牛病毒性腹瀉病毒I［型(BVDV-II)［5,6］o根據(jù)BVDV可否使體外培養(yǎng)的傳代上皮細(xì)胞發(fā)生病變效應(yīng)，可分為兩個(gè)生物型(biotype)：致細(xì)胞病變型(cytopathic,CP)和非致細(xì)胞病變型(noncytopathic,NCP)［7］。兩種生物型的病毒雖然與宿主細(xì)胞的作用不同，但BVDV只有一種血清型。BVDV感染情況復(fù)雜，持續(xù)性感染個(gè)體癥狀隱蔽。動(dòng)物帶毒率高，特別是BVDV嚴(yán)重影響感染動(dòng)物的繁

5、殖，因此給全球畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8］。因而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0IE)列為發(fā)病必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病2—。本研究采集山東省某牛場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉癥狀的病牛的糞便，并對(duì)其進(jìn)行了分離和鑒定，BVDV山東株的獲得為BVDV疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料牛腎細(xì)胞(MDBK)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；DNAMarkerDL2000購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、新生馬血清、胰蛋白酶為HyClone公司生產(chǎn)；MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit,

6、TaKaRapimeScriptTMRT-PCRKit,LATaq酶,dNTP,RNA酶抑制劑，均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。病料樣品為山東省某牛場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉癥狀的病牛的糞便。1.2病毒培養(yǎng)1.2.1病料的處理取腹瀉奶牛糞便，用PBS(含10%雙抗)1：5稀釋。3000r/min離心10min,得到的上清液經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌后得到病料處理液。1.2.2病毒的接種選擇生長(zhǎng)旺盛的MDBK單層細(xì)胞,棄去營(yíng)養(yǎng)液。按細(xì)胞培養(yǎng)瓶1%的量接種病料處理液后37°C感作1h,棄去感作液，加入維持液(2%新生馬血清的DMEM)于

7、5%C02、37°C培養(yǎng)。12h觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)24h后收毒。細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次后再次接種MDBK細(xì)胞，如此傳3代，收獲的細(xì)胞毒用于其它試驗(yàn)。1.3RT-PCR鑒定及序列測(cè)定分析1.3.1引物的設(shè)計(jì)合成根據(jù)已發(fā)表的BVDVNADL株、0sloss株、OrengonC24等毒株的全序列的巳UTR保守區(qū)設(shè)計(jì)BVDV檢測(cè)引物及分型引物［9,10］,引物序列信息見(jiàn)表1,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。稀釋成20umol/L,-20°C保存。