雞IgY輕鏈可變區(qū)ScVL基因T7PDT文庫(kù)構(gòu)建

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1、Y937663單位代碼!Q§3§學(xué)號(hào)2QQ331Q西南矢謦碩士學(xué)位論文雞IgY輕鏈可變區(qū)(ScV。)基因T7PDT文庫(kù)構(gòu)建論文作者：朱萍霞指導(dǎo)教師：黃偉副教授學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)生物技術(shù)提交論文日期；2006年6月1日論文答辯日期：2006年6月5日學(xué)位授予單位：西南大學(xué)中國(guó)·重慶2006年6月西南大學(xué)碩士學(xué)位論文體對(duì)抗原的結(jié)合力，無(wú)限量的合成和表達(dá)實(shí)際上可針對(duì)任何抗原的抗體分子。因此，本研究的目的就是利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建一個(gè)雞單鏈抗體基因文庫(kù)，這為快速研制新抗體奠定基礎(chǔ)。研究方法：(1)根據(jù)Genbank報(bào)道

2、的雞IgYVl框架區(qū)(Framework，F(xiàn)R)FRl和FR4設(shè)計(jì)VH、VL的上下游引物，并引入克隆位點(diǎn)；設(shè)計(jì)親水性的(Gly4Ser)3多肽DNA接頭(Linker)；(2)從8周齡雞脾臟中提取總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為模版，在VH、VL上下游引物作用下PCR擴(kuò)增獲得VH和VL基因，利用重疊(Overlap)PCR將vH和VL通過人工合成的Linker連接成VwLinker-VL，即ScFv基因；(3)通過Sad和NotI酶切重組入T7select10-3b中，經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染E．coliBLT

3、5403株即獲得雞ScFv基因T7PDT文庫(kù)；(4)通過噬菌斑計(jì)數(shù)庫(kù)容量，任取6個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定，純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序，并與Genbank中雞IgV基因序列比對(duì)。(5)選擇4種抗原進(jìn)行生物淘洗；(6)AIV和GPV兩種抗原生物淘洗陽(yáng)性克隆噬菌體液進(jìn)行ELISA競(jìng)爭(zhēng)阻斷試驗(yàn)：(7)抗GPVScVL砸克隆到表達(dá)載體pET28b(+)中，轉(zhuǎn)染Tuner進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)蛋白，采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗體活性。研究結(jié)果：(1)意外獲得雞IgY輕鏈可變區(qū)基因PDT文庫(kù)，命名為雞IgY單輕鏈抗體可變區(qū)(Singlechain

4、oflightvariableregion，ScVL)基因T7PDT文庫(kù)。測(cè)得庫(kù)容為4．5x106pfll，ScVL片段大小為450bp；(2)ScVL序列包含有雞lgYVL基因、Linker序列、未知序列(2top)及重鏈可變區(qū)上游H5引物序列。(3)AIV和OPV抗原生物淘洗均獲陽(yáng)性克隆SCVL／AIV和SCVL／GPV，四輪淘洗后噬菌斑回收率分別增加了1639和61倍。(4)ScVdAIV和ScVI／GPV噬菌體培養(yǎng)液ELISA競(jìng)爭(zhēng)阻斷試驗(yàn)的抑制率分別為17．6％和14．6％。(5)Sc％jGPV克隆在EcoliTuner中

5、表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白質(zhì)，分子量為23kD，競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抑制率達(dá)到28％，說明GPVScVL具有抗體親和性。結(jié)論：構(gòu)建起了雞IgYScVL基因T7PDT文庫(kù)。從該文庫(kù)中成功篩選到抗GPv的ScVL基因克隆在EcoliTuner中表達(dá)。關(guān)鍵詞：雞IgY輕鏈可變區(qū)噬菌體展示基因文庫(kù)ⅡConstructionofSingle．chainLightVariableRegion(ScVL)LibraryofChickenIgYGenesbyT7PhagedisplaytechnologyCandidateZhuPing—xiaSuper

6、visorHuangWet(CollegeofAnimal＆Technology,SouthwestUniversity,Chongqing,China402460)AbstractThreeimmune。globulinclasseshavebeenshownt0existinchicken．IgY．19MandlgA．Theanti·maladiesfunctionoflgYissimilartomammalian19G．butthestructureoflgYisdifferenttomammalianlgG．19Yisco

7、mposedoftwoheavychaMsandtwolightchains，butnohingeregion01"1theheavychain．Theantigenbindingregionsareformedbytheinteractionofthevariablelight(V1)andvariableheavy(VH)domainsatthemninoterminiofthechain．Thethreecomplementarity-determiningregions(CDRs)，locatedinthevariable

8、region,arethespecificboundregionswithantigenepitope．IthasbeenshownthatVLofIgYisencodedbytheVxandJxgenes．ThemechanismofIgYlig