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《道地藥材浙玄參的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、道地藥材浙玄參的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA研究作者：朱振洪，萬海同，余勤，劉文洪，韓進(jìn)【摘要】目的探討道地藥材浙玄參與非道地藥材之間遺傳變異大小，并建立道地藥材浙玄參的品質(zhì)鑒定方法。方法運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)法對產(chǎn)于浙江、山東、湖北的玄參科植物玄參進(jìn)行了分子標(biāo)記研究。結(jié)果共篩選出9條有效引物，獲得142條DNA帶，通過聚類分析，構(gòu)建DNA分子系統(tǒng)樹圖，確定不同居群間的親緣關(guān)系。結(jié)論同種異地藥材所形成的不同居群，具有不同的遺傳多樣性特征。其中浙玄參與山東、湖北玄參存在較大遺傳差異，說明浙玄參作為道地藥材，具有自身獨(dú)特的遺傳特征。【關(guān)鍵
2、詞】道地藥材;玄參;隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA;聚類分析 玄參別名元參、黑參、浙玄參，為玄參科植物玄參ScrophulariuningpoensisHemsl.的干燥根，具有滋陰降火、解毒之功效。主產(chǎn)于浙江，另外在山東、湖北、四川、陜西等也有栽培。其中以浙江產(chǎn)玄參為道地藥材，為著名的“浙八味”之一。由于該藥材品種多、產(chǎn)區(qū)廣，單純地依賴形態(tài)分類、組織學(xué)或化學(xué)指紋如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)等難以區(qū)別[1]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，中藥材生物資源的多樣性是由于其基因多態(tài)性導(dǎo)致的[2]。為從基因角度揭示“道地”7藥材的生物學(xué)本質(zhì)，本文采
3、用RAPD技術(shù)分別對來源于浙江、山東、湖北產(chǎn)地的玄參進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨在為道地藥材浙玄參的藥材鑒定、栽培繁育、質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)?！ ?材料與儀器 1.1供試植物材料分別采于浙江臨安、湖北恩施、山東青州等地。取新鮮健壯嫩葉置液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室-70℃冰箱中保存。 1.2DNA提取試劑提取緩沖液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，500mmol/LNaCl，10mmol/Lβ-巰基乙醇。20%SDS，5mol/LKAc，10mg/mlRNaseA，異丙醇，滅菌水等?！ ?.3PC
4、R試劑10核苷酸隨機(jī)引物由上海生工生物工程公司合成，共70條(序列編號分別為：S1～S40，S71～S90，S111～S120);DNA聚合酶、Buffer等為MBI公司產(chǎn)品。 1.4儀器SIGMA3K-15高速冷凍離心機(jī)，PCR儀(Biometrapersonal，Germany)，瓊脂糖電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。 2方法7 2.1基因組DNA提取方法采用改良SDS法提取基因組[3]，具體操作如下：取1g葉片，剪碎后加入適量PVP，一起于液氮中研磨成粉。轉(zhuǎn)移粉末到加有500μl提取緩沖液的離心管中，輕輕混勻，使
5、粉末充分散開。加入50μl20%SDS溶液，混勻后于65℃水浴中保溫10～15min(間斷晃動(dòng)2～3次)。加入150μl5mol/LKAc，混勻，置冰上20～30min。4℃12000r/min離心15min。上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻。4℃12000r/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置30min。4℃12000r/min離心15min，棄上清液，沉淀自然晾干后加入50μlTE緩沖液溶解，并加入10mg/mlRNA酶1μl，于37℃保溫1h。電泳檢測基因
6、組的完整性。 2.2引物篩選及PCR方法[4]首先進(jìn)行隨機(jī)引物的篩選，10核苷酸隨機(jī)引物購自上海生工(編號分別為：S1～S40，S71～S90，S111～S120)，PCR反應(yīng)體為：10×PCRbuffer2.5μl，25mmol/LMgCl23μl，2.5mmol/L4dNTP1.5μl，引物(0.5μmol/L)1μl，模板DNA(100ng)1μl，Taq聚合酶(5U/μl)0.5μl，補(bǔ)加雙蒸水至25μl。PCR儀的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，36℃退火45s，72℃延伸1min，共44個(gè)循環(huán)，72℃保溫7
7、min。PCR結(jié)束后用1.2%的Agrose進(jìn)行電泳分析結(jié)果?！ ?.3RAPD數(shù)據(jù)分析[5]按瓊脂糖凝膠同一位置上DNA7帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有帶(包括弱帶)記為“1”,無帶記為“0”。利用NTSYS(2.10e)軟件對RAPD電泳結(jié)果進(jìn)行聚類分析。計(jì)算出各物種之間的遺傳距離，并構(gòu)建DNA分子系統(tǒng)樹。 3結(jié)果 3.1改良SDS法提取植物基因組DNA植物基因組抽提方法常用的有CTAB法和SDS法，植物中的主要矛盾是粉碎破壁困難和糖類的影響，所以一般采用陽性表面活性劑的方法。最常用的就是CTAB和SDS。但CTAB的表面活性比SDS差，所以
8、本實(shí)驗(yàn)采用改良SDS法，其基本原理是研磨的組織細(xì)胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖類雜質(zhì)，最后用異丙醇沉淀。用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%)檢測，發(fā)現(xiàn)
