雌二醇對(duì)腦缺血再灌注損傷腦保護(hù)作用機(jī)制的研究

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1、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博卜研究生畢業(yè)論文雌二醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷腦保護(hù)作用機(jī)制的研究博士研究生盧宏導(dǎo)師方思羽教授(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430022)中文摘要流行病學(xué)顯示，絕經(jīng)期后的婦女比年輕婦女更易患神經(jīng)變性疾病如Alzheime's和帕金森氏病、缺血性腦損傷，如中風(fēng)、記憶和認(rèn)知功能障礙。體內(nèi)外一些研究顯示雌激素?zé)o論年輕和年老均可保護(hù)大腦免于損傷。近年對(duì)雌激素腦保護(hù)機(jī)制的深入研究，越來越多的證據(jù)表明雌激素對(duì)缺血性卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用。熱休克蛋白是一組高保守的蛋白質(zhì)，在環(huán)境的應(yīng)激下被誘導(dǎo)出。體內(nèi)外研究證明HS

2、P70具有保護(hù)神經(jīng)元的作用，雌激素能否使這一具有神經(jīng)保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白表達(dá)上調(diào)，目前在局灶性腦缺血/再灌注損傷動(dòng)物模型中未見報(bào)導(dǎo)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(主要包括NTFs,GDNF等)，是一類對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育、分、再生、衰老、死亡和疾病等有著直接或間接作用的蛋白質(zhì)。體內(nèi)外研究NTFs及GDNF對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。但由于外源性BDNF,NGF,GDNF不能透過血腦屏障，如何應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床只有將它們行鞘內(nèi)注射，但存在單次注射作用時(shí)間短，需反復(fù)多次注射，且易引起繼發(fā)性損傷的問題。近年來，一方面人們把目光轉(zhuǎn)向基因治療，構(gòu)建含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的

3、各種病毒載體對(duì)缺血性腦卒中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因治療，目的使缺血性卒中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)增高，以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子腦保護(hù)減輕腦損傷的目的，但基因治療作為探索可能的給藥途徑仍存在諸多問題。另一方面，開發(fā)一些藥物，能通過這些藥物干預(yù)治療促使內(nèi)源性BDNF,NGF,GDNF及其受體的表達(dá)，也將成為藥理學(xué)干預(yù)的新策略。雌激素能否使局灶性腦缺血/再灌注損傷后內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)上調(diào)，從而起到治療作用，目前國(guó)內(nèi)外未見有報(bào)道。腦缺血中存在著細(xì)胞的凋亡尤其是在半暗帶。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的效應(yīng)蛋白，雌

4、激素能否在凋一亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用值得進(jìn)一步研究。，華中科技人學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博IAif"T%生畢業(yè)論文因此婀究通過建立局灶性腦缺血/再灌注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究雌二醇對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷后HSP70,BDNF,NGF,GDNF,bcl-2及caspase-3的影響，以探討雌二醇對(duì)腦保護(hù)的分子機(jī)制，為雌二醇治療腦梗死提供理論上依據(jù)，探索能使有益基因表達(dá)上調(diào)的新的治療藥物。!第一部分雌二醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷HSP7”表達(dá)的影響目的:觀察雌二醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷HSP70表達(dá)的影響，研究雌二醇腦保護(hù)的分子機(jī)制，為雌二醇治療缺血性卒中提供理

5、論依據(jù)。方法:將72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，局灶性腦缺血2h再灌注3h,6h,12h,24h組，4組及雌二醇治療(100ug/kg)+腦缺血2h再灌注3h,6h,12h,24h,4組每組動(dòng)物8只，假手術(shù)組8只口將雌二醇溶于精制植物油內(nèi)于腦缺血前7天每天腹腔注射治療，假手術(shù)組和腦缺血/再灌注組同等條件下給予相同體積的植物油腹腔注射。采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，采用連續(xù)切片免疫組化技術(shù)檢測(cè)腦組織中HSP70o結(jié)果:1.血管內(nèi)皮在假手術(shù)組，腦缺血/再灌注，雌二醇治療組均表達(dá)。2.假手術(shù)組皮層和紋狀體無HSP

6、70表達(dá)。3.雌二醇治療組與腦缺血/再灌注組比較，在再灌注3h,6h表達(dá)無變化，4.雌二醇治療組HSP70表達(dá)，在腦缺血/再灌注后12h皮層明顯高于腦缺血/再灌注組。5.在雌二醇治療組24h較腦缺血/再灌注組HSP70表達(dá)仍有差別。結(jié)論:結(jié)果提示HSP70是缺血后神經(jīng)元損傷的一個(gè)敏感指標(biāo)，它在局灶性腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，給予雌二醇預(yù)先干預(yù)，可以增加腦缺血/再灌注腦組織內(nèi)神經(jīng)元HSP70的表達(dá)，為雌二醇治療缺血性卒中提供了理論依據(jù)，為缺血性卒中提出了新的干預(yù)治療策略。第二部分雌二醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷BDNF,NGF,GDNF

7、表達(dá)的影響目的:觀察雌二醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷BDNF,NGF,GDNF表達(dá)的影響，研究雌二醇與上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的關(guān)系，探索雌二醇腦保護(hù)分子機(jī)制的新觀點(diǎn)。方法:將72只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、局灶性腦缺血2h/再灌注3h,6h,12h,24h組及雌三醇治療(100ug/kg)+fli}j缺血2h/再灌注3h,6h,12h,24h組，每時(shí)間華中科技人學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博卜研究生畢業(yè)論文點(diǎn)8只，假手術(shù)組8只，其中取每時(shí)間點(diǎn)中5只及假手術(shù)組5只行RT-PCR。將雌二醇溶于精制植物油內(nèi)于腦缺血前7天每天腹腔注射治療，假手術(shù)組和腦缺血/再灌注

8、組同等條件下給予相同體積的植物油腹腔注射，采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，采用RT-PCR和連續(xù)切片免疫組化法檢測(cè)各組腦中上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA和蛋白的表達(dá)。戶結(jié)果:(1)RT-PCR顯示