《雙向凝膠電泳技術(shù)》PPT課件

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1、雙向凝膠電泳技術(shù)two-dimensionalgelelectrophoresistechnology(2DE)定義一：以凝膠為載體的雙向電泳。定義二：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量大小，分別在凝膠介質(zhì)二維空間上對蛋白質(zhì)分子進行等電點聚焦和電泳來分離與純化蛋白質(zhì)的方法。雙向凝膠電泳的原理：該技術(shù)是在1975年由意大利生化學(xué)家O’Farrell發(fā)明的。根據(jù)蛋白質(zhì)等電點和分子量的差異，連續(xù)進行成垂直方向的兩次電泳。第一向為等電聚焦（Isoelectricfacusing，IEF)電泳，其基本原理是利用蛋白質(zhì)分子的等電點不同進行蛋白質(zhì)的分離。第二向為十二烷基硫酸鈉-聚丙

2、烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE),它是按蛋白質(zhì)分子量的大小進行分離的,再用考馬斯亮蘭或P銀染進行檢測，經(jīng)Pdquest等軟件對結(jié)果進行對比，解析。2D-PAGE技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵步驟：1、樣品制備（蛋白提取）：（1）細(xì)胞培養(yǎng)、處理和收集；（2）將細(xì)胞在IEF裂解緩沖液中溶解；（3）將樣品離心以去除不容的細(xì)胞碎片和DNA，提取上清，-80℃保存。2、蛋白質(zhì)定量和上樣：（1）固相PH梯度干膠條（immobi-linePHGradient,IPG）水化、等電聚焦；（2）IPG的平衡；（3）SDS-PAGE；(4)蛋白質(zhì)檢測：考馬斯亮蘭染色或銀染色；3、圖像分析及數(shù)據(jù)

3、處理：將染色后凝膠放在GS-710,光密度掃描儀上，掃描后的圖像用PDQUEST2DE軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點進行比較。制備原則：由于雙向電泳所分析樣品的多樣性，沒有一種通用的制備方法適用于各種樣品。但有幾條共同的原則需要遵循（1）盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，打斷蛋白質(zhì)之間的非共價鍵結(jié)合，使樣品中的蛋白質(zhì)以分離的多肽鏈形式存在（2）避免蛋白質(zhì)的修飾作用和蛋白質(zhì)的降解作用（3）避免脂類、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾作用（4）蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性。蛋白質(zhì)樣品處理：在制備蛋白質(zhì)樣品的過程中，最好適用Dnase（脫氧核糖核酸酶）和RnaseA（核糖核酸酶）來降解

4、核酸。如果樣品中含有較多的核酸會增加樣品的粘性并造成非斑點處的背景拖跡，甚至還可能封閉凝膠孔。在蛋白樣品裂解時，應(yīng)以溶解盡可能多的蛋白質(zhì)和保持在整個雙向電泳過程中蛋白質(zhì)的溶解性為主要目標(biāo)。目前增加蛋白質(zhì)溶解性的方法主要是適用變性劑，如尿素、硫脲，可以打破蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，打斷非共價連接。雙向電泳的應(yīng)用雙向電泳的分辨率較高，自第一次應(yīng)用該技術(shù)以來，其分辨率已從15個蛋白質(zhì)點發(fā)展到10000多個蛋白質(zhì)點。一般的雙向電泳也能分辨1000-3000個蛋白質(zhì)點。因此，雙向電泳被廣泛應(yīng)用與農(nóng)業(yè)，醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。由于蛋白質(zhì)的等電點和分子量是兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)，而2DE

5、同時利用了蛋白質(zhì)間的這兩個性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)，因此2DE的分離能力非常強大，它甚至能將細(xì)胞中5000種蛋白分離開，2DE在分離蛋白混合樣品，比較差異方面有不可替代的作用，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可查明大型蛋白復(fù)合物各組組分，與其他生物技術(shù)如分子生物學(xué)，分子遺傳工程，免疫學(xué)，微量蛋白質(zhì)的自動氨基酸序列分析相結(jié)合，可以快速準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)和鑒定新的蛋白質(zhì)。雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是：(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調(diào)節(jié)蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜用到PVDF膜上，但當(dāng)前的技術(shù)還不足以檢出拷貝

6、數(shù)低于1000的蛋白質(zhì)。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（＞200kD）或極?。ǎ?0kD＝蛋白的分離。(4)難溶蛋白的檢測，這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白(5)得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)，因此迫切需要自動二維電泳儀的出現(xiàn)。Thankyou細(xì)胞處理：對于組織細(xì)胞，首先需將其破碎，盡可能地將蛋白質(zhì)組分溶解在緩沖液中，以便在適當(dāng)?shù)碾娪緱l件下分離。組織細(xì)胞破碎的方法包括低滲、勻漿、超聲、反復(fù)凍融等。而對于體液成分，如血清、腹水、尿液等，僅需經(jīng)過稀釋、加熱變性、溶解于適當(dāng)緩沖液便可用于雙向電泳。等電聚焦等電聚焦是20世紀(jì)60年代建立的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，

7、基本原理是利用蛋白質(zhì)或其它兩性分子等電點的不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的pH梯度中進行分離和分析。IEF具有分辨率高（0.01pH單位）、抵消擴散作用、可使?jié)舛容^低的樣品達到高度濃縮等優(yōu)點，不僅可以用來分離兩性大分子，還可以通過測定等電點來鑒定蛋白質(zhì)。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度（CarrierampholytespHgradients）和固體pH梯度（ImmobilizedpHgradients）。前者是在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度，后者是將緩沖基團作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者提高一個數(shù)量級。根據(jù)電泳方式的不同，IEF

8、可分為管狀、薄層、垂直和水平等電聚焦。