雙向電泳技術(shù)ppt課件.ppt

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1、第三章雙向電泳技術(shù)1*1809年俄國物理學(xué)家Peйce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。*1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點(diǎn)。*1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。*1948年Wieland和Fis

2、cher重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進(jìn)行過研究。*從上世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。*由80年代發(fā)展起來的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視

3、。*雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白。2一、電泳的基本原理1、在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)。由F=Eq，f=6πrυη可得υ=Eq/(6πrη)2、帶電顆粒的泳動速度同電場強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷量成正比，與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。第一節(jié)蛋白質(zhì)電泳的基本原理3在一定pH條件下，每一種分子都具有特

4、定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。4二、影響電泳速度的因素1、電場強(qiáng)度；2、緩沖溶液的pH；3、緩沖溶液的離子強(qiáng)度；4、電滲；5、焦耳熱三、電泳的分類按原理分類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。穩(wěn)態(tài)電泳（或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時(shí)間而變化。

5、區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。56?按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。?以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分

6、離。7③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。8?另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳

7、、板電泳、柱電泳。?根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。按pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù)pH電泳，不連續(xù)pH電泳。9四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等。101、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：①幾乎無電滲作用。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對pH和溫度變化

8、較穩(wěn)定。?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。?凝膠孔徑可調(diào)。?分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。112、聚丙烯酰胺凝膠的聚合12催化劑和加速劑的種類①AP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨(簡稱AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活