產(chǎn)油脂微生物

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1、產(chǎn)油脂細(xì)菌的分離及鑒定資助：江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)BE2009651）。2任世英：rsy1314@163.com女，副教授；研究方向：微生物學(xué)。任世英2*李相前*劉飛*（*淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院淮安江蘇223003）提要采用平板分離法，從黃海海域分離到一株聚磷菌，編號(hào)為YSR-3，對其進(jìn)行了部分生理生化特性以及分子特性的研究。結(jié)果表明，YSR-3菌體呈桿狀，大小為3.5μm×1μm，革蘭氏染色陰性，好氧生長；顯微鏡下觀察能運(yùn)動(dòng)。最適培養(yǎng)條件為：氯化鈉濃度3%，生長溫度24℃，起始pH值6.5。該菌能在細(xì)

2、胞內(nèi)累積多磷酸鹽形成異染粒。16SrDNA鑒定結(jié)果表明，YSR-3屬于γ-變形菌綱、鹽單胞菌屬(Halomonas)。與鹽單胞菌屬中的其他已知種比較，YSR-3具有其特性：對氯霉素和卡那霉素敏感、淀粉水解呈陽性、反硝化和幾丁質(zhì)降解呈陰性、能將葡萄糖作為唯一碳源和能源。關(guān)鍵詞聚磷菌，多磷酸鹽，異染粒，鹽單胞菌0引言油脂是構(gòu)成和維持生命的基本物質(zhì)之一，也是重要的工業(yè)原料，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)油脂資源主要來源于動(dòng)植物，能源油則主要來源于礦物資源。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和人們對微生物油脂的深入研究，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂為油

3、脂資源的開發(fā)提供了一條新途徑[1]。微生物生產(chǎn)油脂不僅具有油脂含量高、原料來源豐富、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，而且可用細(xì)胞融合、細(xì)胞誘變等方法，使微生物產(chǎn)生高營養(yǎng)油脂或某些特定脂肪酸組成的特種油脂，如EPA、DHA、類可可脂等。產(chǎn)油脂的微生物主要有：細(xì)菌、微藻、酵母、霉菌等。微生物油脂的研究主要集中在利用微生物生產(chǎn)特種功能油脂和開發(fā)生物柴油。高產(chǎn)油脂或富含稀有脂肪酸產(chǎn)油微生物的研究已有報(bào)道。目前，美國、德國、日本等國已有商品化的微生物油脂面市。在歐洲、中東、南亞和澳洲等地已允許將某些微生物油脂添加到嬰兒食品中[2]

4、。因此開展微生物油脂的研究對解決人類面臨的人口增長、資源短缺、環(huán)境惡化、人類健康等現(xiàn)實(shí)問題具有重要的意義。1材料與方法1.1菌株與試劑所用E.coliTOP10為實(shí)驗(yàn)室保存，用Luria-Bertani培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。合成引物、PCR用試劑、TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、MspI酶切試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成，其他藥品和試劑為國產(chǎn)分析純。1.2培養(yǎng)基1.2.1分離培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖5，尿素1，硫酸銨1，磷酸二氫鉀2.5

5、，磷酸氫二鈉0.5，七水合硫酸鎂1，七水合硫酸鐵0.1，酵母膏0.5，瓊脂20，pH4.5。1.2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖4，硫酸銨2，酵母膏1.9，磷酸氫二鈉2，磷酸二氫鉀7，七水合硫酸鎂1.5，pH6.0。1.2.3肉汁胨培養(yǎng)基（g/L）蛋白胨10，NaCl5，牛肉膏3，pH7.3。1.2.4LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7。以上培養(yǎng)基均于0.1Mpa，121℃蒸氣滅菌20min。1.3樣品采集與處理用取樣鏟將有機(jī)質(zhì)豐富的土壤表層5cm左右的浮土除去，取5-25cm處的土樣2g，

6、裝入含有100mL無菌水的250mL容量的三角瓶，加入玻璃珠，28℃，150r/min搖床振蕩30min備用。1.4菌株的分離純化取振蕩后液體0.5mL，進(jìn)行梯度稀釋，取0.1mL的10-6梯度菌液，涂布于分離培養(yǎng)基平板，28℃恒溫靜置培養(yǎng)2-4天，將長出的單菌落在相同培養(yǎng)條件下，劃線分離3次以上，進(jìn)行菌株純化，分別編號(hào)。1.5產(chǎn)油脂菌株的鑒定對純化到的菌株進(jìn)行蘇丹黑染色[ddd]，顯微鏡觀察是否形成油脂，獲得實(shí)驗(yàn)菌株。1.6種子液制備挑取單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃恒溫，150r/min振蕩培養(yǎng)12h，作為種子

7、液。按裝瓶培養(yǎng)基體積的10%進(jìn)行移種。以下試驗(yàn)無特別說明均按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。1.7生長曲線繪制將種子液移種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔1h取樣，用7300型分光光度計(jì)測OD600nm。1.8胞內(nèi)油脂的提取將發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液在3000r/min下離心30min，收集得濕菌體。胞內(nèi)油脂提取方法[16]如下：1.8.1鹽酸水解法精確稱取2.5g濕菌體，添加40mL4mol/L的鹽酸，室溫下靜置20min，沸水浴加熱10min，加入適量氯仿-甲醇（2：1，v/v），振蕩30min，然后在3000r/min下離心30min，分液

8、，取下層氯仿層，75℃水浴揮發(fā)除去氯仿即得油脂。計(jì)算油脂產(chǎn)率，以油脂（g）/濕菌體（g）表示油脂產(chǎn)率。1.8.2有機(jī)溶劑法精確稱取2.5g濕菌體，菌體沉淀按每克菌體3mL的比例加入氯仿：甲醇（1：2，v/v）提取液，充分振蕩2min，再加入1mL氯仿，振蕩混勻，加1.5mLH2O，振蕩混勻后3000r/min離心30min，取氯仿