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1、微生物油脂工藝研究論文１材料與方法１．１材料微生物油脂（含４３％ＡＲＡ），嘉必優(yōu)生物工程（武漢）有限公司贈送；固定化酶（ＬｉｐｏｚｙｍｅＲＭＩＭ）購于北京諾維信公司；１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ、１，２－ＡＲＡ－ＤＡＧ購于瑞典Ｌａｒｏｄａｎ公司；正己烷、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇均為色譜純，購于德國ＣＮＷ公司；氫氧化鈉、尿素、無水硫酸鎂、鹽酸、乙醇、石油醚、甘油、無水乙醚、４Ａ型分子篩均為分析純，購于國藥化學試劑集團。１．２試驗儀器分析天平（ＡＵＹ１２０，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，Ｊａｐａｎ）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ＲＥ－５２Ａ，上海亞榮生化儀器）；集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋（ＤＦ－１０１Ｓ，
2、鞏義市予華儀器有限責任公司）；氣相色譜儀（Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ，美國Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；高效液相色譜儀（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００，美國Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；質(zhì)譜儀（ＡＢ４０００Ｑ－Ｔｒａｐ，美國ＡＢ公司）；微型旋渦混合儀（ＷＨ－３，上海滬西分析儀器有限公司）。１．３試驗方法１．３．１尿素包埋法純化微生物油脂于５００ｍＬ三口瓶中加入４０ｇ微生物油脂、２００ｍＬ無水乙醇、３０％氫氧化鈉（以微生物油脂質(zhì)量計），充氮氣保護下，在恒溫水浴加熱攪拌器上８０℃水浴回流２ｈ，加入１００ｍＬ的蒸餾水，攪拌均勻并冷卻至室溫，加鹽酸酸化至ｐＨ＝１～２左右［１８］。用無水乙醚∶石
3、油醚＝１∶１（Ｖ／Ｖ）混合溶液萃?。病炒?，將萃取液水洗至中性，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機相，得到游離形態(tài)的脂肪酸混合物。將其加入到尿素／乙醇溶液中，氮氣保護下回流２ｈ后，迅速轉(zhuǎn)移到２５０ｍＬ的錐形瓶中，密封后于－２０℃6學海無涯冰箱中結(jié)晶過夜。所得到的尿素包合物經(jīng)抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和萃取后，經(jīng)無水硫酸鎂脫水得到純化后的脂肪酸。稱重并計算回收率。并取少量原樣品和尿素包埋后的樣品進行甲酯化衍生化處理，經(jīng)ＧＣ檢測尿素包埋前后ＡＲＡ的含量變化。１．３．２酶法合成富含ＡＲＡ的１，３－ＤＡＧ按照一定的摩爾比準確稱?。粒遥梁透视陀冢玻埃恚虄煽趫A底燒瓶中，氮氣保護條件下，將其置于一定溫度的
4、水浴鍋中，待攪拌均勻后，加入一定量的固定化酶ＬｉｐｏｚｙｍｅＲＭＩＭ和２０％（占底物總質(zhì)量）已活化的４Ａ型分子篩，在２００ｒ／ｍｉｎ的轉(zhuǎn)速下攪拌反應(yīng)，按一定的時間間隔取樣，采用ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ分析酯化后產(chǎn)物及各組分的相對百分含量。１．３．３脂肪酸的ＧＣ檢測脂肪酸的甲酯化衍生化處理采用本實驗室建立的方法［１９］。ＧＣ檢測條件為色譜柱：ＨＰ－ＦＦＡＰ毛細管柱（Ａｇｉｌｅｎｔ，３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．５μｍ）；檢測器：氫離子火焰化檢測器（ＦｌａｍｅＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｏｒ，ＦＩＤ）；以氮氣為載氣，進樣口壓力為２５ｐｓｉ，進樣量為１μＬ，分流比為１∶
5、３０；升溫程序：初始溫度２１０℃保持７ｍｉｎ，以２０℃／ｍｉｎ升溫至２３０℃并保持５ｍｉｎ，總分析時間為１２ｍｉｎ；進樣口和檢測器溫度分別為２６０℃和２８０℃。采用面積歸一法計算脂肪酸的相對百分含量。１．３．４產(chǎn)物中１，３－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ檢測產(chǎn)物中１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ檢測條件為色譜柱：Ａｇｉｌｅｎｔ－ＳＩＬ（５μｍ，２．０ｍｍ×２５０ｍｍ）；流動相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝８０∶２０∶１，（Ｖ／Ｖ／Ｖ）；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫：４０℃；進樣量：１０μＬ；總時間：２０ｍｉｎ。檢測器ＭＳ的條件為ＡＰＣＩ模式：正離子；ＣＵＲ：１３７．
6、９ｋＰａ；ＣＡＤ：ｍｅｄｉｕｍ；ＮＣ：２７．３８ｋＰａ；溫度（ＴＥＭ）：４５０℃；掃描模式：ＭＲＭ－ＥＰＩ；掃描速度：１０００ｕ／ｓ；離子源氣體１（ｉｏｎｓｏｕｒｃｅｇａｓ１，ＧＳ１）∶３４４．７５ｋＰａ；輔助加熱（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｈｅａｔｅｒ，ｉｈｅ）：開；ＤＰ：８０Ｖ；ＣＥ：３５Ｖ和５５Ｖ；碰撞電壓擺幅（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙｓｐｒｅａｄ，ＣＥＳ）：５Ｖ；碰撞室輸出電壓（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｃｅｌｌｅｘｉｔｐｒｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＸＰ）１７Ｖ；質(zhì)量范圍：５００～１０００ｍ／ｚ。采用面積歸一法計算產(chǎn)物中１，３－ＤＡＧ的相對百分含量。１．３．５數(shù)據(jù)分析本實
7、驗采用ＳＡＳ（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）９．０統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗重復(fù)三次，取其平均值。用Ｏｒｉｇｉｎ作圖工具，對結(jié)果進行分析。6學海無涯２結(jié)果與分析２．１尿素包埋法純化微生物油脂中的ＡＲＡ尿素包埋法作為一種普遍的富集ＬＣ－ＰＵＦＡｓ的方法，一直受到人們的青睞［２１］。本實驗中，當尿素∶混合脂肪酸∶甲醇比為２ｇ∶１ｇ∶２０ｍＬ，結(jié)晶溫度為－２０℃時，經(jīng)ＧＣ檢測分析后，ＡＲＡ的相對百分含量由原來的４３％（如圖１中Ａ）提高到８３％，且回收率為５４．３５％。力為２５ｐｓｉ，進樣量為１μＬ，分流比為１∶３０；升溫程序：初始溫度２１０℃保持７
8、ｍｉｎ，以
