細(xì)菌誘導(dǎo)的銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞型分化研究

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1、扉頁(yè)：獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的集體和個(gè)人均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：2整多照同期：墊!埠￡墮綽!a論文使用和授權(quán)說(shuō)明本人完全了解云南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文和論文電子版；允許論文被查閱或借閱：學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。(保密的論文在解密后應(yīng)遵

2、循此規(guī)定)研究生簽名：扭圭垂導(dǎo)師簽名：遺蟲(chóng)羔日本人及導(dǎo)師同意將學(xué)位論文提交至清華大學(xué)“中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)電子雜志社”進(jìn)行電子和網(wǎng)絡(luò)出版，并編入CNKI系列數(shù)據(jù)庫(kù)，傳播本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，同意按《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)出版章程》規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。研究生簽名：導(dǎo)師簽名：日期：云南大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要銅綠微囊藻是滇池藍(lán)藻水華的主要優(yōu)勢(shì)藻種，具有強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，這是該種在世界范圍內(nèi)廣泛分布和形成藍(lán)藻水花的重要原因。在自然水體中銅綠微囊藻常以群體的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，群體形成是其適應(yīng)和抗逆性產(chǎn)生的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)許多生物因子

3、和非生物因子都能誘導(dǎo)藍(lán)藻群體的形成，但群體形成的特點(diǎn)及分子機(jī)制還不清楚。本研究小組發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)誘導(dǎo)銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換具有重要作用，并發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌誘導(dǎo)的銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中，存在細(xì)胞型分化現(xiàn)象。本研究擬進(jìn)一步分析銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中，不同細(xì)胞型的特點(diǎn)和分化機(jī)理，及其在適應(yīng)性產(chǎn)生和異常增殖中的潛在作用。以前期篩選出的韋氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)菌株N12為材料，利用其能穩(wěn)定誘導(dǎo)銅綠微囊藻形成群體的特點(diǎn)，建立基于N12菌與銅綠微囊藻共培的研究體系，追蹤銅綠微囊藻細(xì)胞的聚集過(guò)程，和這一個(gè)過(guò)程中藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)和

4、表型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以探索細(xì)胞型分化的特點(diǎn)和產(chǎn)生的原因。利用DAPI染色藻細(xì)胞擬核區(qū)結(jié)合葉綠素自發(fā)熒光，熒光顯微觀察群體形成中藻細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)；利用外加實(shí)驗(yàn)，研究信號(hào)分子AHLs和ABA對(duì)細(xì)菌誘導(dǎo)的藻表型轉(zhuǎn)換過(guò)程的影響：利用Q．PCR技術(shù)篩選出四類(lèi)與藻細(xì)胞聚結(jié)相關(guān)的基因(碳酸酐酶相關(guān)基因ecaB、藻毒素相關(guān)基因m叫和mcyB、胞外多糖相關(guān)基[]epsL及偽空泡相關(guān)基因酊別2)，進(jìn)一步采用熒光原位雜交技術(shù)就聚團(tuán)過(guò)程中這五種基因的表達(dá)情況進(jìn)行原位分析，并和自然水體微囊藻群體進(jìn)行比較，得到的主要結(jié)果如下：1．研究體系的建立一一菌N1

5、2誘導(dǎo)銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換及其特點(diǎn)。銅綠微囊藻在與N12菌共培下能形成群體，群體形成分不同的兩個(gè)階段：小群體的聚團(tuán)(游離細(xì)胞的抱團(tuán))和大群體的聚結(jié)；群體形成的大小和速率具有濃度依賴(lài)性；形成的結(jié)構(gòu)與自然群體具有較高的相似性；群體形成中，藻細(xì)胞的胞內(nèi)外可溶性多糖含量急劇增加，藻膽蛋白和別藻藍(lán)蛋白含量發(fā)生改變，共培36h矛N48d,時(shí)，為對(duì)照組的3．89平D3．77倍，3．98和4．06倍；膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量在群體形成初期急劇上升，之后下降。2．銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中細(xì)胞型的分化。DAPI染色結(jié)合葉綠素自發(fā)熒光觀察發(fā)現(xiàn)：不管是自然群體，還

6、是菌誘導(dǎo)產(chǎn)生銅綠微囊藻群體，都存在兩種細(xì)云南大學(xué)碩士學(xué)位論文胞型：A型細(xì)胞(Apoptosiscell)和R型細(xì)胞(Resistancecell)。A型細(xì)胞較大，胞質(zhì)綠，內(nèi)含深色不規(guī)則分布顆粒，熒光下擬核區(qū)大，結(jié)構(gòu)較松散，胞質(zhì)中葉綠素自發(fā)熒光的紅色明顯低于R型細(xì)胞，其中還分布有黃色透明顆粒，這種黃色顆粒的數(shù)目隨發(fā)育進(jìn)程而增加；而R型在明視場(chǎng)下，細(xì)胞較小，胞質(zhì)較淺，胞內(nèi)所含內(nèi)含物少，除核心部分可見(jiàn)擬核所在的結(jié)構(gòu)之外，基本不含其他結(jié)構(gòu)，熒光下呈明亮的紅色。隨著聚團(tuán)過(guò)程的進(jìn)行，A型細(xì)胞比率增加，在與N12共培24h時(shí)最高(是R型細(xì)胞比率的7．7

7、1倍)，與Nl菌共培12h時(shí)最高(是R型細(xì)胞的5．1倍)：培養(yǎng)后期，R型細(xì)胞比例慢慢增加，與N12菌共培48h時(shí)R型細(xì)胞所占比率數(shù)是A型的2．15倍，與N1菌共培60h時(shí)R型細(xì)胞比率是A型的8．1倍。兩種細(xì)胞型比例的變化，揭示在群體形成中存在細(xì)胞型的更替。3．AHLs和ABA對(duì)細(xì)菌誘導(dǎo)銅綠微囊藻表型轉(zhuǎn)換及細(xì)胞型分化的影響。外加AHLs能提高菌N12脅迫下銅綠微囊藻的存活率，加速藻細(xì)胞聚團(tuán)速率，形成更大團(tuán)塊。夕['力IAHLs改變?nèi)后w細(xì)胞中細(xì)胞型組成，增加了R型細(xì)胞所占比率，48h達(dá)到8I．53％；外加ABA到藻．NI的共培組中，隨共培時(shí)間

8、R型細(xì)胞逐漸增加，48h所占比率達(dá)到A型細(xì)胞的8．95倍，“AHLs一藻”和“ABA～藻”處理組各個(gè)時(shí)間段兩種類(lèi)型細(xì)胞所占比率無(wú)明顯差異。4．運(yùn)用熒光原位雜交技術(shù)，分析五個(gè)基因在正常培養(yǎng)周期和