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《p53基因的克隆、原核表達及功能初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、論文題目：學科專業(yè)：學位申請人：指導老師：p53基因的克隆、原核表達及功能初步研究動物學李春炎李興玉教授摘要目的原核表達P53重組蛋白，檢澳t]P53重組蛋白對人類白血病細胞系K562和人肝癌細胞系SMMC．7721體外增殖的影響。方法運用PCR技術鑒定]"pET-p53重組質粒導,KBL21菌株中p53基因的存在，并在IPTG的誘導下，大量產(chǎn)生外源基因產(chǎn)物。通過Ni．NAT親和層析柱純化分離P53蛋白，SDS．PAGE確定該蛋白準確性。以不同濃度經(jīng)磁性熒光納米粒子(FMNP)修飾后的P53重組蛋白誘導K562細胞和SMMC
2、．7721細胞，用M'Iq'LI',色法、集落形成法、流式細胞術(FCM)測定P53蛋白對靶細胞增殖的影響。利用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察經(jīng)磁性熒光納米粒子修飾的P53重組蛋白在細胞中的定位。結果1．成功的構建了含人野生型p53基因的原核表達載體，分離純化了P53重組蛋白。2．磁性熒光納米粒子修飾的P53重組蛋白較未修飾的蛋白有更好的凋亡誘導作用，且磁性納米粒子本身并不具細胞毒害作用；3．P53重組蛋白抑制l(562腫瘤細胞的生成，隨藥物劑量增大：細胞凋亡率上升，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為6．74／比g／ml；4．隨
3、著P53重組蛋白濃度的增加，SMMC．7721細胞存活率顯著降低，并發(fā)現(xiàn)該蛋白能促進腫瘤細胞凋亡，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為12．39／tg／ml；5．激光共聚集顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)P53重組蛋白主要定位于細胞核，胞漿也有少量分布。結論原核表達的P53重組蛋白具有野生型P53(wtp53)蛋白活性，體外實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)磁性熒光納米粒子修飾的P53重組蛋白能夠抑制I為62細胞和SMMC．7721細胞生長并促使它們發(fā)生凋亡。關鍵詞：p53基因；細胞凋亡；磁性熒光納米粒子Title：CloningandProkary
4、oticExpressionofp53geneandPreliminaryStudyofItsFunctionMajor：ZoologyApplication：LiChun-yanSupervisor：Prof．LiXing-yuAbstractObjectiveToexpressandpurifypET—p53fusionproteinandinvestigatetheeffectsoftheproteinontheproliferationofHumanleukemiacelllineK562andHumanhepato
5、cellularcarcinomacelllineSMMC-7721／nvitro．MethodsThefragmentofhumanwildtypep53eDNAwasamplifiedbyPCRandtheexpressionplasmidofpET-p53wasconstructed．RecombinantplasmidsweretransformedintoE．coliBL21，theninducedbyIPTGatlmmol／LTheproteinwaspurifiedbythecolumnofNi—NATanda
6、nalyzedbySDS-PAGE．Aftertreatedwithfluorescentmagneticnanoparticles(FMNP)modifiedP53proteinwithdifferentconcentrations，theproliferationofK562weretestedbyMTrassay，cloneformationandFCM．Wealsousedlaserscanningconfocalmicroscope(LSCM)toobservethedistributionoffluorescen
7、tmagneticnanoparticlesmodifiedP53fusionproteinincells．ResultsProkaryoticexpressionvectorsofpET-p53wereconstructedcorrectly．pET-p53fusionproteinweresuccessfullyexpressedandpurified．Withitsincreasingconcentrations，modifiedP53fusionproteinreverseditseffectontumorcells
8、significantly．TheratioofinhibitionwaslinearrelationtotheconcentrationofP53●fusionproteinwhenconcentrationoftheproteinwasbetween0．1／tg／mland100／比g
