《原生質(zhì)體融合》PPT課件

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1、一、原生質(zhì)體分離二、原生質(zhì)體分離及純化操作三、原生質(zhì)體培養(yǎng)四、體細(xì)胞雜交（原生質(zhì)體融合）五、原生質(zhì)體的遺傳飾變第三節(jié)、植物原生質(zhì)體技術(shù)及應(yīng)用體細(xì)胞雜交研究歷程及一般概念體細(xì)胞雜交的一般流程雜交細(xì)胞的鑒定123細(xì)胞雜交的應(yīng)用4（一）體細(xì)胞雜交的含義及研究歷程概念：不同親本（種間或?qū)匍g等）的原生質(zhì)體，在人工誘導(dǎo)下，相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合、核融合并形成雜種細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株。這一過程稱為原生質(zhì)體融合或細(xì)胞雜交。◆使植物無性雜交成為可能◆使有性雜交根本無法獲得的種間、屬間、科間遠(yuǎn)緣雜種成為現(xiàn)實(shí)◆打破了物種間的界限原生質(zhì)體融合的意

2、義植物體細(xì)胞雜交的幾個(gè)重要進(jìn)展1960年Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這是第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種；1974年Kao將聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年Melchers獲得第一個(gè)屬間體細(xì)胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。（二）植物細(xì)胞融合

3、的程序：◆原生質(zhì)體分離的分離、純化◆融合方法選擇◆雜種細(xì)胞的篩選◆愈傷組織形成、分化植株再生◆雜種植物的鑒定原生質(zhì)體融合的方法聚乙二醇PEG）化學(xué)方法電脈沖物理方法生物方法仙臺(tái)病毒(Sendaivirus)NaNO3處理高pH-高濃度Ga2+飛秒激光誘導(dǎo)融合電融合空間細(xì)胞融合（1）電融合法：指利用改變電場誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此相連成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖電壓促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，達(dá)到原生質(zhì)體融合的方法?！綦娙诤咸攸c(diǎn)：效率高對原生質(zhì)體傷害性小對融合細(xì)胞數(shù)易于控制方法：微電極法和雙向電泳法雙向電泳法：通過電泳，兩細(xì)胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質(zhì)分子分離，產(chǎn)

4、生了無蛋白的類脂區(qū)。電融合儀Fusionphasesofoat（燕麥）protoplasts(Avenasativa)微電極法：指利用改變電場誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此相連成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖電壓促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，達(dá)到原生質(zhì)體融合的方法。實(shí)際操作：先把待融合的細(xì)胞或原生質(zhì)體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場中，在非均勻交流電場中形成項(xiàng)鏈狀排列；完整煙草原生質(zhì)體（40×）原生質(zhì)體成串（40×）微電極法：再用1~5V/cm直流電脈沖/微秒沖擊細(xì)胞或原生質(zhì)體的粘接點(diǎn)，細(xì)胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細(xì)胞質(zhì)得以交換；最后導(dǎo)致新的球狀

5、細(xì)胞的形成。1、原生質(zhì)體在誘融劑或正弦電場作用下凝集，彼此靠近；2、兩個(gè)相鄰原生質(zhì)體之間的質(zhì)膜相互融合，隨后兩個(gè)親本原生質(zhì)體質(zhì)膜上的受體、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的質(zhì)膜上重新分布；3、細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合；4、細(xì)胞核發(fā)生融合，形成單核融合細(xì)胞。融合過程：（2）聚二乙醇誘導(dǎo)融合法◆PEG融合的機(jī)理：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵。當(dāng)PEG分子鏈足夠長時(shí)，它在相鄰原生質(zhì)體表面之間有分子橋、改變膜表面物理化學(xué)性質(zhì)和增加類脂膜流動(dòng)性作用，引發(fā)原生質(zhì)體的粘連。當(dāng)PEG分子被洗脫后，膜上的電荷便重新分布，從而導(dǎo)致原

6、生質(zhì)體融合。PEG的選用：一般選擇相對分子質(zhì)量為4000獲6000PEG對細(xì)胞有毒害作用，用離子交換樹脂純化可消除其對細(xì)胞的毒害作用。優(yōu)點(diǎn)：成本低、不需要特殊的設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率高；融合過程不受物種限制缺點(diǎn)：融合過程繁瑣、PEG可能對細(xì)胞造成毒害PEG融合所需試劑融合液：pH5.6CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH

7、0.169P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇PEG法的流程P1P2P1P2融合融合液稀釋洗滌培養(yǎng)選擇鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉鹽類融合的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：鹽類融合劑對原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點(diǎn)：融合頻率低，對液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合（3）鹽類融合法（4）高Ca2+和高pH值融合Ca2+濃度0.05mol/LpH9.5-10.5取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1

8、:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸鈉緩沖調(diào)節(jié)pH值到10.5，