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1、酶聯(lián)免疫吸附反應(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點ELISA的應用實例一、基本原理是利用抗原抗體進行的檢測技術(shù)。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測標本中的相應抗體或抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或
2、抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。其方法簡單，方便訊速，特異性強。二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用
3、，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應.酶底物顯色反應測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色 黃色 棕色 蘭色 藍綠色492460449 425 642堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色 紅色400 500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色 深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光 黃色360,450 4
4、20ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋
5、白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成固相抗體－抗原復合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體加底物進行酶催化反應根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。（1）雙抗體夾心法測定抗原A.將抗體吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗體復合物;C.加酶
6、標抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。雙抗原夾心法（抗-HBs等）示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標記抗原復合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標記抗原抗體抗原固相載體雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。間接法是檢測抗體最常用的方法，其原
7、理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法酶抗抗體酶標記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖間接法測抗體傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標本:使相應抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復
8、合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定（三）競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體
