資源描述:
《馬麝朊蛋白基因的克隆與原核表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、甘肅農業(yè)大學頓士學位論文摘要摘要【目的】為了解馬麝朊蛋白基因結構特征和其細胞型朊蛋白的性質,以填補國內外對馬麝朊蛋白基因研究的空白,并為進一步研究馬麝朊蛋白結構特征和動物朊病毒病傳染的種間屏障機制提供實驗材料和理論依據(jù),本研究準備對馬麝朊蛋白基因進行克隆及其原核表達。【方法】應用分子克隆和DNA重組技術,以健康成年馬麝全血中提取的基因組總DNA為材料,用所設計引物以PCR擴增細胞型朊蛋白基因,并克隆目的DNA片段至IJpMD18.T載體,建立完整朊蛋白基因克隆,測序后以DNAstar軟件比較分析其核苷酸和推導氨基酸序列特征及其同源
2、性;以馬麝完整朊蛋白基因重組質粒為材料,PCR擴增表達目的基因片段,構建重組表達質粒pGEX.MuPrP(85~233),轉化S.coliBL21(DE3),進行誘導表達條件優(yōu)化和重組菌的誘導表達,以SDS.PAGE和Westemblotting鑒定表達產物,從而建立馬麝重組朊蛋白(85~233)的原核表達菌GST-MuPrP(85~233)?!窘Y果】序列分析表明,4個馬麝朊蛋白基因的完整編碼區(qū)均為包含在單一外顯子內完整開放閱讀框,其全長為771bp,含5個短而富含G.c的元件,可編碼5個八肽(九肽)重復Pro-His-Gly·G
3、ly-Gly—Trp-Gly-Gin或Pro—Gin/His-Gly—Ala/Gly-Gly—Gly—Trp—Gly-Gin及24個氨基酸的N-端信號肽和23個氨基酸的C.端信號肽。與同科不同亞科的馬鹿和白尾鹿以及不同科的奶牛和綿羊朊蛋白基因序列比較,核苷酸序列和推導氨基酸序列同源性為97.3%~98.2%和97.7%~98.8%,說明朊蛋白基因在同科和不同科的反芻動物間是保守的。馬麝朊蛋白基因與馬鹿和白尾鹿相比,存在G57A、S100N、N173S、T177N和M208I5個異義突變:與綿羊相比,存在G57A、$98T和S100
4、N3個異義突變;與牛相比,除缺失一個八肽重復外,還存在G57A、G100N、S146N、H158Y、E189Q和M208I6個異義突變。G57A突變發(fā)生于第一個重復九肽的第4位,該突變在己知人和動物朊蛋白基因中未曾發(fā)現(xiàn),為馬麝朊蛋白基因所特有。所構建的馬麝重組朊蛋白(85~233)原核表達載體pGEX—MuPrP(85~233),經轉化EcoliBL21(DE3),成功地獲得重組表達菌EcoliGST-MuPrP(85~233),可表達預期大小約為42.4ku的融合蛋白。在誘導表達優(yōu)化條件下,該重組菌可產生表達量占細菌總蛋白量30
5、%以上的融合蛋白。免疫印跡檢查,融合蛋白GST-MuPrP(85~233)可與抗牛單克隆抗體4C1l反應,各氨基酸突變并不影響單抗4Cll的識別表位?!娟P鍵詞】馬麝;朊蛋白基因:DNA克??;序列分析;重組朊蛋自;原核細胞表達¨肅農業(yè)大學頌士學位論文摘要SummaryobieetiveThisresearchistoobtain研onprotein(PrP)geneDNAcloningandprokaryoticexpressionproteinsofonemuskdeer.Thenthecharacterofgenestructu
6、reandtheproperityofcelluarisoforlTlofmuskdeerPrPcallberealized;theresultwillenricht11eresearchofthePrPgeneaboutruminantintheworld,andbringexperimentalmaterialsfortheresearchofproteinstructureandthemechanismofinterspeciesbarrierforPrPinfection..MethodsAdoptingthemolecu
7、larcloningandtherecombinantDNAtechnology,usingthetotalDNAswhichwereextractedfromperiphemlwhole·bloodofmuskdeer,thePrPgeneswereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)withapairofprimers,andthenclonedintopMD18-TVector,theentirecloneofPrPgeneWaSconstructed.Aftersequencing
8、,thenucleotideswereanalyzed&theaminoacidsequencesandtheirhomologywerededucedbyDNAstarsoftware;takingtheentirerecombinantPrPg