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1、16July2021實時熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司主要內(nèi)容RealTimePCR基礎知識12RealTimePCR實驗方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應用實例RealTimePCR基礎知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎知識1RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗證基因芯片結(jié)果驗證siRNA效果確認mRNA表達量分析病毒及病原菌檢測物
2、種鑒定基因分型絕對定量相對定量RealTimePCR的原理激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴增裝置實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行分析的方法。RealTimePCRCt值RealTimePCR基礎知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎知識1TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有d
3、sDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenIPrimer退火FFFFSYBRGreenI法作用機理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFFTaqMan法作用機理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標記一個報告基團（Reporter），3’端標記一個淬滅基團（Quencher）。RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設計要求高Probe法Probe
4、合成費用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達量分析等SYBRGreenI法簡便易行價格便宜要求反應的特異性不能進行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測主要內(nèi)容2RealTimePCR實驗方法反轉(zhuǎn)錄反應RealTimePCR反應RTPrimer的選擇RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer目的片段在距Poly(A)Tail1.5kb
5、p以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達量分析，提升反應檢測的靈敏度。RTPrimer的選擇RealTimePCR引物設計目的是獲得目的基因，對非特
6、異性反應和引物二聚體要求不嚴格。目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設計要求不同=>對引物設計要求嚴格普通PCR引物RealTimePCR引物兩條引物的Tm值盡量接近，應用專用軟件計算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認引物特異性★★★特異性△引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補序列△引物3’末端避免2base以上
7、的互補序列★★★互補性3’末端序列△整體上堿基不能過偏△個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)△避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★△3’末端避免GCrich或ATrich△3’末端堿基最好為G或C△3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設計引物，限制基因組DNA擴增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設計原則探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長度探針5’末端的第一個堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設計△整體上堿基不能過偏△個別部分避免G
8、Crich或ATrich(特別是3’端)；避免T/C連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補序列★★★互補性BLAST
