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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司24August2021主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測(cè)方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測(cè)差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測(cè)物種
2、鑒定基因分型絕對(duì)定量相對(duì)定量RealTimePCR的原理激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測(cè)方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針?lè)≧ealTimePCR的檢測(cè)方法熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA
3、雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBRGreenIPrimer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFFTaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計(jì)要求高Probe法Probe合成費(fèi)用高SY
4、BRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法簡(jiǎn)便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測(cè)主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)RTPrimer的選擇RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以?xún)?nèi)適用，RT效率
5、較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測(cè)的靈敏度。RTPrimer的選擇RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不
6、嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同=>對(duì)引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專(zhuān)用軟件計(jì)算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer長(zhǎng)度80-150bp(盡量限制在300bp以?xún)?nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性△引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列△引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序
7、列△整體上堿基不能過(guò)偏△個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)△避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★△3’末端避免GCrich或ATrich△3’末端堿基最好為G或C△3’末端堿基盡量避免為T(mén)盡量在Exonjunction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)原則探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長(zhǎng)度探針5’末端的第一個(gè)堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對(duì)較高的區(qū)域設(shè)計(jì)△整體上堿基不能過(guò)偏△個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端
8、)；避免T/C連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性BLA
