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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司7/28/2021主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹27/28/2021RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹37/28/2021RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)
2、入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測物種鑒定基因分型絕對(duì)定量相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹47/28/2021RealTimePCR的原理激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹57/28/2021RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1實(shí)時(shí)熒
3、光定量PCR介紹67/28/2021TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹77/28/2021熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹87/28/2021Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPo
4、l.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFF實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹97/28/2021TaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹107/28/2021RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹117/28/2021One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計(jì)要求高Probe法
5、Probe合成費(fèi)用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法簡便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹127/28/2021主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹137/28/2021RTPrimer的選擇RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpeci
6、ficPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹147/28/2021目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表
7、達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RTPrimer的選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹157/28/2021RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同=>對(duì)引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹167/28/2
8、021兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性△引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列△引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列△整體上堿基不能過偏△個(gè)別部分避免G
