資源描述：
《禽呼腸孤病毒σ3基因的真核表達及σNS基因的原核表達與序列分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、禽呼腸孤病毒O3基因真核表達質粒免疫效果的研究及ONS基因的原核表達與序列分析摘要禽呼腸孤病毒(Avianreovirus，ARV)感染在世界范圍內存在，主要引起雞和火雞的病毒性關節(jié)炎＼腱鞘炎，吸收障礙綜合癥和慢性呼吸道疾病。感染雞出現(xiàn)免疫抑制而引起繼發(fā)性感染，死亡率升高等等，造成比較大的經濟損失。近年來研究者對ARV，進行了不同的檢測診斷方法及不同類型疫苗的探索。課題分別對ARVo3基因構建的真核表達載體(pcDNA-o3)、構建的重組載體pcDNA．O3的免疫效果、ARV非結構蛋白oNS的克隆表達及序列分析進行了研究。采用RT-PCR技術擴增禽呼腸孤病毒ARVS1133株的O3基
2、因，將o3基。因克隆至真核表達載體pcDNA3．1(+)載體上，獲得重組質粒經PCR、酶切以及序列分析鑒定，表明插入的片段為o3目的基因，插入的位置、大小和閱碼框架均正確，成功構建了真核表達載體重組質粒pcDNA—o3。分別制備pcDNA．o3DNA疫苗、ARV滅活苗及o3蛋白苗，將制備的疫苗分別免疫SPF雞(各10羽)2次后，用ARVS1133株對DNA疫苗免疫組、r滅活苗免疫組、o3蛋白免疫組及對照組進行攻毒。攻毒4天后采集雞的內臟組織器官經處理后使用RT-PCR方法進行檢測。RT-PCR的檢測結果為DNA疫苗免疫組(10％)檢出率與對照組(30．9％)差異顯著(p<0．05)，
3、與滅活苗免疫組(7．4％)及o3蛋白免疫組(3．7％)差異不顯著(p>0．05)。說明用構建的pcDNA—O3免疫SPF雞，雞只獲得了較好的免疫保護。研究還采用RT-PCR技術，擴增10株禽呼腸孤病毒oNS非結構蛋白基因，將S1133株與廣西分離株R2的0NS基因克隆到表達載體PGEX-4T-I獲得重組質粒(PGEx一1133．oNS，PGEX．R2．oNS)，其他8株的oNS基因克隆至PMDl8．T載體，對陽性質粒進行序列測定。對陽性重組質粒IPTG的誘導濃度、誘導時間和誘導溫度等條件進行了試驗。結果顯示，目的蛋白分子量約為66．2ku，約占菌體總量的31．5％．33．3％，1PT
4、G最佳誘導濃度為0．8mmol／L，最佳誘導時間為4h，最適誘導溫度為28．37。C。37℃及32℃誘導時，目的蛋白ONS主要以包涵體的形式存在，28℃誘導時，目的蛋白oNS主要以可溶性的方式表達。利用28℃誘導表達目的蛋白ONS，用谷胱苷肽活化的Sepharose4B親和層析柱純化，測定純化蛋白的濃度。結果顯示純化后目的蛋白純度達到93％，濃度為0．91mg／ml。Western-blotting分析表明，目的蛋白能夠與ARV陽性血清發(fā)生特異性反應，表明該重組蛋白具有較好的抗原性。陽性重組質粒序列測定結果表明，所構建的克隆質粒中均含有相應的oNS蛋白基因，大小為1107bp，編碼3
5、69個氨基酸。序列分析表明，此8株ARV的oNS基因的核苷酸，與標準毒株S1133和1733株的同源性為98．8％～99．9％，其中R1株在第80位缺失了一個核苷酸。結果表明，除R1株外，其它ARV毒株的oNS基因變異不大。關鍵字：禽呼腸孤病毒o3genepeDNA3．1(+)oNSgene表達序列分析l*STUDIESoNTHEIMM叮NOLoGICALEFFICACYoFRECoM皿INANTPLASM【DWITHo3GENEAGAINST√研ANImoⅥIⅢSANDCLoMNGANDSEQUENCEANALYSISoFoNSGENEAvianreovirus(ARV)infec
6、tionexsitinthepoultryindustryaroundtheworld．ARVscancauseviralarthritis，tenosynovitis，malabsorptionandchronicrespiratorydiseases，anditisalsooneoftheimmunosuppressivediseasesandsubsequentlyresultsinmoresusceptivetotheinfectionofotherpathogens，andcauseseriouseconomylossforpoultryindustry．Alotofres
7、earchersareexploringthedifferentdiagnosticmethodanddifferentvaccineofARVinrecentyears·Theconstructionofrecombinantplasmid(pcDNA—O3)with03geneagainstAvianreovirus；theimmunologicalefficacyoftherecombinantplasmid(pcDNA一03)；thecloning
