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《HMME光動(dòng)力學(xué)療法作用于人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7的實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、HlVIME光動(dòng)力學(xué)療法作用于人類乳腺癌細(xì)胞MCF．7的實(shí)驗(yàn)研究專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程碩士生：于麗指導(dǎo)教師：李曉原副教授摘要光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamicther印y，PDT)是一種非常有發(fā)展前景的能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死的腫瘤治療方法。光動(dòng)力學(xué)的作用因素包括對(duì)光敏感的物質(zhì)——光敏劑、光以及氧分子。光敏劑可以被病變靶組織選擇性的吸收，在合適波長的光的激發(fā)下，通過能量的轉(zhuǎn)換產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，從而造成對(duì)靶組織的損傷。第一代光敏劑(例如光敏素photofrin)在臨床的應(yīng)用方面存在一些不利因素，如化學(xué)成分復(fù)雜、對(duì)
2、波長大于600nm以上可見光區(qū)吸收弱以及治療后皮膚長時(shí)間的光敏感(長達(dá)lO周)等。因此現(xiàn)在研究了大量的第二代光敏劑，以應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。血卟啉單甲醚(hematoporphyrinmonomethyletIler，HMME)是一種新型的卟啉類第二代光敏劑，并己在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中證明了它的高效性。但目前尚無HMME—PDT對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的研究，對(duì)其殺傷腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制的研究也需要進(jìn)一步的探討。本課題擬采用這種新型光敏劑血卟啉單甲醚，用波長為632．8nm的He-Ne激光照射，研究不同光敏劑劑量及不同
3、激光照射劑量的光動(dòng)力學(xué)作用對(duì)MCF．7的影響，用CCK．8檢測(cè)HMME．PDT對(duì)MCF．7細(xì)胞的生長抑制率，用透射電鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HMME在細(xì)胞內(nèi)的分布以及線粒體功能的改變來探討HMME．PDT誘導(dǎo)凋亡可能的作用機(jī)制。方法：1．細(xì)胞抑制率檢測(cè)先將傳代培養(yǎng)的MCF．7細(xì)胞，以l×105／ml的濃度均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100ul，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞周期同步化。然后加入不同終濃度的光敏劑在37'C避光孵育2小時(shí)，再用
4、PBS洗3次，加入完全培養(yǎng)基，即刻進(jìn)行激光照射。照光后將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱繼續(xù)避光培養(yǎng)24小時(shí)，然后每孔加入10山CellCountingKit8(CCK．8)，在37。C避光孵育3小時(shí)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度。用處理組的吸光度與對(duì)照組吸光度相比來表示各組的細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)分PDT組和對(duì)照組。PDT組共設(shè)5個(gè)光敏劑濃度，5I_tg／ml(A組)、10I_tg／ml(B組)、20斗g／ml(C組)、40p．g／ml(D組)、80}Lg／ml①組)，每組用5個(gè)激光照射劑量進(jìn)行照射，1．2J／cm2(a組)、
5、2．4J／cm2(b組)、4．8J／cm2(c組)、9．6J／cm2(d組)、19．2J／em2(E組)。對(duì)照組分單純光敏劑組(5rtg／ml、10l_tg／ml、20I．tg／ml、40p．g／ml、801．tg／m1)、單純激光照射組(1．2J／cm2、2．4J／cm2、4．8j／cm2、9．6J／em2、19．2J／cm2)和空自對(duì)照組。每個(gè)處理組設(shè)8孔。2．形態(tài)學(xué)觀察(電鏡和熒光顯微鏡)體外傳代培養(yǎng)的MCF．7接種于35mm培養(yǎng)皿，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞周期同步化。PDT組加入10p．
6、g／ml的光敏劑HMME，激光照射能量密度為2．4J／cm2?？瞻讓?duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)24小時(shí)，分別進(jìn)行Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察和固定包埋切片電鏡觀察。3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和壞死率體外培養(yǎng)的MCF．7均勻接種35mm培養(yǎng)皿，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞周期同步化。PDT處理步驟同形態(tài)學(xué)觀察。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)24小時(shí)，收集各組細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和壞死率。4．激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)將細(xì)胞接種于35mmPetri培養(yǎng)皿。細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)
7、驗(yàn)需要分別用HMME和不同的熒光探針進(jìn)行孵育，然后用KRH緩沖液沖洗3次，加入lmlKRH維持細(xì)胞的生理狀態(tài)。置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1．單純激光組照射組的吸光度與空白對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即單純激光II照射對(duì)MCF．7的增殖無明顯抑制作用。單純光敏劑組的吸光度與空白對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即單純光敏劑孵育對(duì)MCF-7的增殖也無明顯抑制作用。各PDT組的吸光度與空白對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即當(dāng)激光和光敏劑同時(shí)存在時(shí)，對(duì)MCF．7有生長抑制作用。PDT對(duì)MCF．7的抑制程度與光敏劑濃度
8、和激光照射劑量在一定范圍內(nèi)呈正比關(guān)系。當(dāng)光敏劑濃度升至40“g／ml、激光照射能量密度增至4．8J／cIn2以上時(shí)，細(xì)胞抑制率不再隨著劑量的增加而增加，組間進(jìn)行比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)光敏劑濃度增至801．tg／ml時(shí)，細(xì)胞抑制率隨激光照射能量密度增加而增長的趨勢(shì)變緩，相鄰組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)激光照射能量密度增至4．8J／cm2以上時(shí)，組問差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2．電鏡、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HMME．PDT可誘導(dǎo)M
