(交流)別小瞧了ELISA

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1、（交流）別小瞧了ELISA第一次作ELISA，真***的簡單，偶暗想。第二次做，咿，結(jié)果差別這么大（同一份標(biāo)本）怎么還有跳孔。第三次，決定做的認(rèn)真一些，爭取作到同一份標(biāo)本，做兩到三次，板間無差異，發(fā)覺很難。原來ELISA也這么講究?？纯碋LISA的注意事項(xiàng)吧：（一）加樣　　在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行4－5次加樣。在定性測定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡?！　。ǘ?/p>

2、保溫　　在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)?！　。ㄈ┫礈臁　∠礈煸贓LISA過程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原

3、或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質(zhì)即右達(dá)到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對(duì)聚山梨酯編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用?！　∠礈烊绮粡氐祝貏e在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附

4、，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾。　　ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；②將洗滌液注滿板孔；③放置2min，略作搖動(dòng)；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。請(qǐng)叫大蝦！在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。其中“45加樣”是什么意思？woshilaodaYYYwrote:請(qǐng)叫大蝦！在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。其中“45加樣”是什么意思？這里的45加樣，應(yīng)當(dāng)為45度加樣，即加樣槍的吸頭所在的直線應(yīng)當(dāng)與板條所在的

5、直線呈45度角。ELISA中加樣須注意如下問題：1.吸取樣品時(shí)，加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體；加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體，這樣會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確！2.不要將吸頭伸入孔中，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會(huì)將孔中的液體吹起來，加樣不準(zhǔn)確！正確的加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁加入，應(yīng)注意：1.角度太小，會(huì)使液體殘留在孔壁上，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)確！2.吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處！45度加樣不知道根據(jù)何在？我看到Eppendorf建議是垂直不超過30度傾角才比較準(zhǔn)確。好像R&D公司說明書講要加孔底?。ㄖ笩o液體時(shí)），當(dāng)然不能觸到板子。所以我采用上圖第一種做法，不對(duì)嗎?

6、因?yàn)檫€要做，想知道準(zhǔn)確的加樣法能給我講一下ELISA嗎?[外行]呵呵.THANKU.各位園子里的新老戰(zhàn)友，不好意思，最近比較忙，上的次數(shù)少了，沒想到這篇小帖子引起這么多人關(guān)注，謝謝捧場！再者由于我的疏忽，造成大家誤解，特表示歉意。1.towoshilaodaYYY：“45”本意是4－5次加樣，加包被液，一抗，二抗，底物等。而不是45度加樣。2.coffejumps所說應(yīng)該有他的道理，不過ELISA過程中主要是用移液器加樣，只要保證把液體加到孔底，而且不沾于孔壁，至于采用多少度角，應(yīng)該問題不大，自己把握了，呵呵。3.tocuilq2000：園子里有好多關(guān)于ELISA原理，步驟底帖子，你用“

7、ELISA”+原理或步驟search一下，好好看一下，會(huì)有不少收獲底。我下面列幾個(gè)，你可以先看看：>最后想說的是,盡信書不如無書，實(shí)驗(yàn)都是人作的，只要不違背基本的科學(xué)原則，你也可以有自己的創(chuàng)新嘛，本來實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)就是要試著作一做。你也許就是未來的科學(xué)大家，實(shí)驗(yàn)“標(biāo)準(zhǔn)”的制定者，也說不定呢？！不知到我說的對(duì)不對(duì)。祝大家實(shí)驗(yàn)順利！to:shanying:thankuverymuch.希望以后多多指教。還有我想請(qǐng)問PCR技術(shù)在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用有