酶蛋白的生產(chǎn)與分離純化

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1、酶的生產(chǎn)與分離純化酶的生產(chǎn)與分離純化主要內(nèi)容：2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.3酶的分離純化2.4酶分離、純化的評(píng)價(jià)2.5酶的劑型與保存2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀2.1.1．新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用：*三種方法：*組織提?。耗竟系鞍酌?、凝乳蛋白酶*微生物發(fā)酵：最大量的來(lái)源*化學(xué)及生物合成：生物重組*高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊2.1.2.集中壟斷，市場(chǎng)全球化：*規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場(chǎng)90%*丹麥諾和諾得公司（諾維信

2、novozymes）→1978年進(jìn)入中國(guó)諾維信公司，占50%市場(chǎng)（天津）；*美國(guó)杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國(guó)，與無(wú)錫合資，控股80%（無(wú)錫），兩家公司銷(xiāo)售額占全球2/3；（2005年杰能科國(guó)際公司被丹尼斯克公司收購(gòu)）；*芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3.品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大*目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。*我國(guó)2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬(wàn)噸，100家，市場(chǎng)份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。*

3、國(guó)際以液體、顆粒為主。*國(guó)內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類(lèi)占了97%，顯然不合理。*重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國(guó)內(nèi)尚未投入生產(chǎn);*我國(guó)有7家上市公司介入酶制劑開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。2.1.4.應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：*美國(guó)酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。2.2酶的發(fā)酵技術(shù)*利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：*(1)微生物種類(lèi)多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。*(2)微生物生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。*(3)微生物培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜。*(4)可以采用微電腦

4、等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。*(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開(kāi)發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。2.2.1產(chǎn)酶微生物*菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類(lèi)、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有50～60種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)*2.2.2.1培養(yǎng)基1酶的生產(chǎn)與分離純化*培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分

5、是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。（1）碳源*碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來(lái)源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。有機(jī)碳的主要來(lái)源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分來(lái)作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。*不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)

6、根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營(yíng)養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。*例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。*（2）氮源*氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種，常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚(yú)粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；

7、無(wú)機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。*不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無(wú)機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)的30%。只用有機(jī)氮源而不用無(wú)機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3%的無(wú)機(jī)氮源。*（3）碳氮比*在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類(lèi)、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的

8、不同而改變的。*一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75%、玉米粉0.625%、魚(yú)粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)