Multipoints Mutagenesis Kit

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1、TaKaRaCode：D407MultipointsMutagenesisKit(20次量)目錄內(nèi)容頁碼●制品說明1●制品內(nèi)容1●保存1●本Kit以外必備試劑和儀器2●引物設(shè)計說明2●試劑盒原理3●使用ControlPlasmid時的實驗例3●多位點(diǎn)定點(diǎn)突變實驗操作方法7●實驗例10●Q&A10●參考文獻(xiàn)10●制品說明本試劑盒是利用一對設(shè)計特殊的錨定引物（AnchorPrimer）及幾條定點(diǎn)突變引物對DNA多個不同位點(diǎn)同時進(jìn)行定點(diǎn)突變的試劑盒。錨定引物“尾巴”上的特異性序列是與大多數(shù)基因都不相匹配的，因此保證了PCR擴(kuò)增的特異性。本試劑盒的主要原理是：設(shè)計合成同一方向的錨定引物及定點(diǎn)突變引物，

2、將錨定引物及定點(diǎn)突變引物用T4PolynucleotideKinase磷酸化后與模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行退火，再使用T4DNAPolymerase和T4DNALigase進(jìn)行延伸和連接形成突變單鏈，然后使用錨定引物“尾巴”上的特異性引物（ETailF/ETailR）和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR對突變單鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的雙鏈PCR產(chǎn)物克隆回原載體中，即可達(dá)到實驗?zāi)康?，獲得目的突變體。本試劑盒操作快速簡單，只需一天時間便可以完成整個突變操作。本試劑盒尤其適用于插入片段長度在1.0kbp以下的多位點(diǎn)基因突變實驗，對于1.0kbp以上的DNA片段的多位點(diǎn)基因突變，由于引物退火的不完全、P

3、CR擴(kuò)增中可能引入新的突變點(diǎn)等原因，可能降低實驗成功率。本公司曾經(jīng)使用本試劑盒，成功進(jìn)行了1.5kbpDNA片段的多位點(diǎn)基因突變實驗。本試劑盒中的AnchorF1和AnchorR1引物可供克隆于pUC系列載體或pBluescript系列載體中的DNA片段的多位點(diǎn)基因突變實驗，使用方便。使用試劑盒中的ControlPlasmid及各種Control實驗用引物可進(jìn)行Control實驗?！裰破穬?nèi)容（20次量）T4PolynucleotideKinase（10U/μl）40μl10×ReactionBuffer*140μlATP（10mM）48μl10×AnnealingBuffer40μl10×Ex

4、tensionBuffer60μlT4DNALigase（60U/μl）20μlT4DNAPolymerase（1U/μl）20μlTMPrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μl）10μlTM2+5×PrimeSTARBuffer（Mgplus）200μldNTPMixture（2.5mMeach）80μlControlPlasmid（50fmol/μl）20μlControlPrimerMix（12.5pmol/μleach）20μlControlAnchorF（8pmol/μl）5μlAnchorF1（8pmol/μl）*220μlAnchorR1（8pmol/μl）

5、*225μlETailF（10pmol/μl）25μlETailR（10pmol/μl）25μlLigationSolutionI100μl*110×ReactionBuffer于-20℃保存時會有白色渾濁出現(xiàn)，溶解后不影響反應(yīng)。*2AnchorF1與AnchorR1是基于pUC系列載體、pBluescript系列載體設(shè)計的錨定引物。AnchorF1的3’端和AnchorR1的5’端與上述系列載體的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)序列完全一致；AnchorF1的5’端與ETailF序列完全相同，AnchorR1的3’端與ETailR序列完全互補(bǔ)。當(dāng)要突變的DNA片段克隆于上述系列載體中時，錨定引物可以直接使用A

6、nchorF1和AnchorR1?！癖４?-20℃-1-●本Kit以外必備試劑和儀器·PCR擴(kuò)增儀?！に″??！ば⌒碗x心機(jī)?！じ鞣N移液槍?！じ鞣N型號的Microtube、Tip等?！garoseGelDNAPurificationKitVer2.0（TaKaRaCode:DV805A）?！NAFragmentPurificationKitVer2.0（TaKaRaCode:DV807A）?！deI、HindⅢ（用于Control實驗）。·JM109CompetentCell·滅菌蒸餾水。●引物設(shè)計說明1.Kit中的AnchorF1與AnchorR1是基于pUC系列載體、pBluescri

7、pt系列載體設(shè)計的錨定引物。當(dāng)要突變的DNA片段克隆于上述系列載體中時，錨定引物可以直接使用AnchorF1和AnchorR1。2.當(dāng)要突變的DNA片段克隆于其他載體中時，則需要設(shè)計錨定引物。上游錨定引物AnchorF的3’端和下游錨定引物AnchorR的5’端應(yīng)與載體序列完全一致；AnchorF的5’端應(yīng)與ETailF序列完全相同（見下述【各種引物序列】表中AnchorF1的陰影部分），Anch