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《乳酸發(fā)酵實驗》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸1前言乳酸是一種天然有機化合物，它廣泛地應(yīng)用在食品、化工、醫(yī)藥品中，是一種重要的原料。乳酸可分為L-乳酸和D-乳酸兩種類型，人體不能過多的攝入D-乳酸，過多的攝入會使新陳代謝發(fā)生紊亂。L-乳酸的聚合物是一種可降解的、具有良好韌性的新型材料，其原料為可再生資源。因此L-乳酸已近被認(rèn)為最具發(fā)展?jié)摿Φ牟牧?。目前已?jīng)在社會上各個領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。目前社會工業(yè)上最主要生產(chǎn)的是L-乳酸，而且大都采用米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸，這種方法具有操作簡單、原料便宜、產(chǎn)物純度高、菌種易于培養(yǎng)等優(yōu)點。但由于技術(shù)不夠高使其也有
2、缺點，如生產(chǎn)的周期長、糖的轉(zhuǎn)化效率太低、菌種易于結(jié)成團。抑制了工業(yè)上的應(yīng)用，因此必須解決上述問題，才能使米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸在工業(yè)上得到廣泛的應(yīng)用。2目的本實驗的目的主要是認(rèn)識米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的過程，掌握米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，使學(xué)生對米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸有感性的認(rèn)識，并掌握葡萄糖及乳酸的化學(xué)測定方法。3原理葡萄糖進入細(xì)胞內(nèi)后，在細(xì)胞液中通過EMP途徑被分解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下直接脫氫形成目標(biāo)產(chǎn)物—L-乳酸，其反應(yīng)式如下：2C6H12O6→3C3H6O3+C2H5OH+CO24實驗材料4
3、.1菌種本實驗所使用的菌種為米根霉(Rhizopusoryzae)。4.2使用的主要試劑與儀器實驗試劑試劑名稱規(guī)格葡萄糖分析純木糖分析純瓊脂粉生化試劑硫酸銨分析純3,5一二硝基水楊酸分析純七水合硫酸鋅分析純碳酸鈣分析純鈣羧酸分析純磷酸二氫鉀分析純結(jié)晶酚分析純氯化鈉分析純氫氧化鈉分析純乙二胺四乙酸二鈉分析純無水亞硫酸鈉分析純鹽酸分析純酒石酸鉀鈉分析純實驗儀器名稱SW-CJ-2F型超凈工作臺SHP-160D型智能低溫生化培養(yǎng)箱HYG-B全溫度搖瓶柜TU-1810紫外可見分光光度計LDZX-50KBS立體壓力蒸汽滅菌器JZC-T
4、SC電子計重天平CP114型電子天平DHG-9101-OS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱HH-S恒溫水浴鍋BCD-209KHA型冰箱3L發(fā)酵罐5培養(yǎng)基5.1菌種斜面保藏培養(yǎng)基取新鮮的馬鈴薯，去皮以后稱取200g切成小塊，加入1000mL水，煮沸20min以后(能用玻璃棒戳破即可)，用紗布過濾，在濾液中加入20g瓊脂粉和20g葡萄糖，然后加熱融化并補足失水至1000mL。放置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃下滅菌15min后，將其倒入三角瓶中冷卻制成斜面培養(yǎng)基。5.2種子與發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)(1)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，(NH
5、4)2SO44g/L、KH2PO40.3g/L、ZnSO4·7H2O0.44g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L，CaCO340g/L，pH值自然，以上培養(yǎng)基皆于121℃滅菌15min。種子培養(yǎng)基葡萄糖為40g/L。6檢測方法6.1EDTA法測定發(fā)酵液中乳酸的含量（1）溶液的配制(1)0.05mol/LEDTA溶液：準(zhǔn)確稱取18.612g的EDTA，加水溶解以后定容至1000ml。(2)鈣指示劑：稱取1g鈣羧酸和100g的氯化鈉，使兩者充分混合后，保存在棕色瓶中備用。（2）實驗方法取lmL發(fā)酵液(V1)加入到盛有10
6、0mL蒸餾水的三角瓶中，然后加入10ml1mol/L的NaOH溶液與少量鈣指示劑，用0.05mol/LEDTA溶液滴定。溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為滴定終點，消耗EDTA溶液的體積記為V2。（3）結(jié)果計算L-乳酸的含量(g/L)=(90.08×0.1×V1)/V2V1:滴定到終點時消耗的EDTA溶液體積(ml)V2:X吸取的發(fā)酵液體積(通常為1ml)6.2DNS法發(fā)測定酵液中殘?zhí)呛坑捎趩翁呛杏坞x的酮基或醛基，具有還原性，因此單糖屬于還原糖。而蔗糖和多糖等，由于不含游離的醛基或酮基，因而他們屬于非還原性糖。多糖能夠被水解為
7、單糖，此時可以通過測定水解后單糖的含量來測定原來總糖的含量。發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定方法主要有菲林試劑法、高效液相色譜法和DNS法。本實驗主要采用DNS法來測定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?。?）溶液的配制DNS顯色劑：準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀鈉182g、重蒸餾酚4g、無水亞硫酸鈉3g、氫氧化鈉20g，3,5－二硝基水楊酸6.3g，加水溶解以后定溶到1000ml。將配置好的溶液倒入棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容至1000ml。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取9只試管，編號為1～9。分別量取0、0.
8、2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL的1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于8只試管中，加入1ml的蒸餾水，然后分別加入DNS試劑1.5mL。將各試管中的溶液混合均勻，放置于水浴鍋中100℃加熱5min，取出后立即用流動冷水冷卻至室溫，再向各試管中加入21.5ml蒸餾水，混合均勻。在540nm光波波長下
