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《植物原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、第九章植物原生質體培養(yǎng) 與體細胞雜交原生質體培養(yǎng)的意義第一節(jié)原生質體的分離與純化第二節(jié)影響原生質體產量和活力的因素第三節(jié)原生質體的培養(yǎng)第四節(jié)由原生質體再生植株第五節(jié)體細胞雜交第六節(jié)原生質體的應用價值原生質體培養(yǎng)的意義1、原生質體的特性（1）去壁的原生質體容易實現外源遺傳物質的導入和吸收。（2）原生質體具有細胞全能性。（3）不同來源的原生質體具有彼此融合的能力。2、原生質體培養(yǎng)應用（1）克服植物有性雜交的障礙，擴大物種間遺傳物質交流的范圍，創(chuàng)造有利變異，培育新品種。（2）作為獨特的實驗系統(tǒng)，用于體細胞遺傳、生理、病理等方面的基礎理論研究。第一節(jié)原生質體的分離與純化一、原生質體的分離（一）分離原
2、生質體的材料來源（二）分離方法1．機械分離法2．酶法分離（三）技術程序二、原生質體的純化（一）分離原生質體的材料來源游離原生質體時，植物葉片、花瓣、果實組織、子葉、下胚軸、幼根、莖葉、愈傷組織、懸浮細胞等都可作為材料來源，但常用于分離原生質體的材料為：1、葉片葉片來源豐富，供應及時，有明顯的葉綠體存在時也便于在細胞融合中識別。2、試管苗的子葉、胚軸或莖尖等無菌材料3、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞。（二）分離原生質體的方法1、機械分離法2、酶法分離酶法分離是利用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶類降解細胞壁成分，獲得原生質體的方法。（1）分離原生質體的酶類（2）酶解分離原生質體的方法（3）酶解分離原生
3、質體應注意的問題?根據植物材料種類選擇所用酶的種類、處理濃度、和處理時間。?酶解分離時應提供適宜的滲透壓保護，以防原生質體破裂。（1）分離原生質體的酶類酶的類型作用常用種類纖維素酶降解細胞壁中纖維素成分，游離原生質體。OnozukaR-10半纖維素酶降解細胞壁中的半纖維素成分。PhozymeHP-150果膠酶降解相鄰細胞間的果膠質，使細胞游離。MacerozymeR-10（2）酶解分離原生質體的方法①兩步分離法這種分離方法是先用果膠酶離析植物組織，使植物細胞從組織中分離出來，然后收集細胞經洗滌后用纖維素酶解離細胞壁，最后獲得原生質體。②一步分離法即把一定量纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料
4、進行一次性處理，處理溫度25~30℃，處理的時間根據材料及酶濃度的不同而不同，可為2～24h。（三）游離原生質體的技術程序1、材料準備：稱重、滅菌與研碎。2、預處理：研磨、切割、暗培養(yǎng)等。3、酶解：加入酶液，保育處理；4、收集純化：過濾去除組織碎塊；離心純化原生質體。5、活力檢測6、原生質體的培養(yǎng)原生質體?再生細胞壁?細胞分裂，形成愈傷組織?愈傷組織分化成苗二、原生質體的純化（一）離心沉淀法(過濾濃縮法）（二）接口法選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度，原生質體經適當速度離心后即介于兩種溶液之間。（二）漂浮法（一）離心沉淀法1、方法：
5、先將經酶處理的原生質體懸浮液用400目網篩過濾，濾液經500～1000r/min離心5～6min后，吸去上清液，然后用一般洗滌液重新懸浮，離心沉淀，如此重復2～3次。最后再用原生質體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質體備用。2、注意：（1）整個過程用相同的滲透液，滲透壓以稍高于原生質體內滲透壓，細胞稍微發(fā)生質壁分離為好。（2）常用的原生質體清洗介質為CPW溶液；（3）這種方法簡便，但不能完全除盡少量脫壁不完全的細胞和破碎的原生質體。（二）接口法1、方法：先在離心管底加入山梨醇或蔗糖的濃溶液（21%），再小心的加入過濾處理的酶-原生質體混合液，以合適的速度離心，原生質體將聚集于兩液面之間。小心取出原生質
6、體轉入另一離心管，用清洗介質清洗、離心，重復3次。最后以適當的密度懸浮于液體培養(yǎng)基中。2、優(yōu)劣該法可收集較純的原生質體，且原生質體破碎較少。但采用的高滲溶液往往對原生質體傷害較大。用此法的關鍵是控制好蔗糖或山梨醇的濃度及離心速度，使原生質體漂浮于單一界面，且不影響原生質體的穩(wěn)定性和活力。第二節(jié)影響原生質體產量 和活力的因素一、材料來源（一）植物葉片（二）培養(yǎng)細胞二、預處理三、酶處理四、滲透壓（一）植物葉片當從植物葉片分離原生質體時，植株的生長環(huán)境、植株年齡等對原生質體的分離和培養(yǎng)影響較大。１、植株年齡對一年生草本：生長40-60天的幼葉；對多年生木本：幼齡且充分展開的葉片。２、母株生長環(huán)境母
7、株生長在低光強（10001x）、短日照、溫度20℃~25℃、相對濕度60％～80％的條件下，以及較高的氮肥供應。３、采用離體苗葉片（二）培養(yǎng)細胞由培養(yǎng)細胞分離原生質體，其產量取決于培養(yǎng)細胞的生長速率和生長時期。頻繁繼代可促進細胞的旺盛分裂，生長時期以處于對數生長早期的細胞為好。即：頻繁繼代（每2~3天繼代1次）的懸浮培養(yǎng)物以及處于對數生長早期的細胞是最適宜的供體材料。利用培養(yǎng)細胞分離的原生質體往往容易實現細胞
