植物育種學(xué)-植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交

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1、植物育種學(xué)第12章----生物技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用第二節(jié)---植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交制作人：2010級種子二班宋子超201027922012.11.11植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是指將植物細胞去壁后，在無菌條件下，使其進一步生長發(fā)育的技術(shù)。體細胞雜交是在離體條件下將同一物種或不同物種的原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)并獲得雜種細胞的再生植株。自1971年煙草葉片分離原生質(zhì)體并培養(yǎng)獲得再生植株以來，已有280余種植物原生質(zhì)體再生植株問世。原生質(zhì)體融合克服了植物種屬間生殖障礙，為新種質(zhì)的創(chuàng)造提供了一條有效途徑過程：1、

2、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)2、原生質(zhì)體融合3、雜種細胞的選擇4、雜種細胞的鑒定一、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)（一）原生質(zhì)體的分離1、制備原生質(zhì)的材料：分為①、自然條件下生長的植株：可以從植株各個組織器官分離原生質(zhì)體，常用的是葉肉細胞（來源方便、供應(yīng)及時、有明顯的葉綠體便于在融合中識別）②、無菌幼苗：無菌幼苗的子葉、下胚軸和根均可分離。優(yōu)點：無需經(jīng)表面滅菌處理，避免殺菌劑對材料的傷害，且實驗結(jié)果容易重復(fù)。缺點：培養(yǎng)室光照不夠，苗弱制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量比較低，質(zhì)膜較易破。③、外植體來源的愈傷組織、體細胞胚及懸浮培養(yǎng)細胞：優(yōu)點：這種材料可避免環(huán)境

3、條件的不良影響，可常年供應(yīng)，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便。缺點：染色體不穩(wěn)定，長期培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物是整倍體與非整倍體的混合物，使植株再生率降低。2、材料的預(yù)處理目的是為了提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和代謝活力；逐步降低植物細胞水勢，增強原生質(zhì)體對培養(yǎng)及高滲透壓的適應(yīng)；使游離的原生質(zhì)體更能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。處理方法：①：預(yù)培養(yǎng)法：材料先在一定配方培養(yǎng)基上培養(yǎng)然后再分離原生質(zhì)體②：暗處理法：材料暗處培養(yǎng)一定時間再分離原生質(zhì)體③：藥物及添加劑處理法：材料在添加劑或藥物處理后，再進行原生質(zhì)體的分離④：萎蔫處理法：離體葉片置日光或燈光下

4、照射2~3小時，葉片稍萎調(diào)，易于撕去下表皮，有利于酶降解葉肉細胞壁⑤：更新培養(yǎng)基法3、原生質(zhì)體的分離植物原生質(zhì)體分離有機械分離和酶分離法，目前一般采用酶法分離，酶法分離是指在酶的作用下分解細胞壁獲得原生質(zhì)體，優(yōu)點是快速大量。酶法分離注意事項：①、酶的種類和用量：根據(jù)植物材料不同以及細胞壁成分不同確定。纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶。②、酶液的滲透勢：細胞內(nèi)外的滲透壓必須平衡否則原生質(zhì)體易破裂。③、酶液的酸堿度：酶液的PH對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有很大的影響。不同植物材料對酶液的PH要求有別。④、溫度環(huán)境：分離時間與溫度和不同的材料

5、酶活力植物細胞特點有關(guān)。⑤、通氣條件對原生質(zhì)體的量和質(zhì)也有明顯的影響：通氣良好原生質(zhì)體量多健康，否則產(chǎn)量低健康的少。4、原生質(zhì)體的純化酶分解后的植物組織是由未消化的細胞和細胞團、破碎細胞及原生質(zhì)體等組成的混合物，需提純。方法有：①：過濾-離心法：簡單易收集大量原生質(zhì)體，常用。②：漂浮法：根據(jù)原生質(zhì)體、細胞或細胞碎片的相對密度不同而設(shè)計的。5、原生質(zhì)體的活力測定原生質(zhì)體的活力測定，原生質(zhì)體的活力測定決定以后的培養(yǎng)成功。形態(tài)識別：完整飽滿的細胞質(zhì)、顏色鮮艷、正常膨大。→有活力?。ǘ?、原生質(zhì)體培養(yǎng)1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：不同植物的原

6、生質(zhì)體對營養(yǎng)需求不同。KM培養(yǎng)基、V-KM培養(yǎng)基除培養(yǎng)基外還注意：（1）、植物激素：生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，2,4-D。（2）、原生質(zhì)體的密度（3）、光照和溫度（4）、氮源種類2、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法3、原生質(zhì)體培養(yǎng)過程培養(yǎng)條件滿足的條件下，原生質(zhì)體首先會形成新的細胞壁，繼而進行分裂，形成細胞團。在促進分化的條件下還能分化出芽、莖、根，再生成完整植株。（1）、細胞壁再生：再生壁開始的時間隨所用的植物材料種類及取材來源而異。（2）、細胞分裂：第一次細胞分裂依賴于壁的形成。（3）、植株再生：原生質(zhì)體形成小的細胞

7、團或愈傷組織，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上后就開始形態(tài)發(fā)生而逐漸長成完整的植株。原生質(zhì)體來源的細胞器官發(fā)生也可以通過兩條途徑：一是通過愈傷組織形成不定芽，另一條途徑是由植物原生質(zhì)體再生細胞在培養(yǎng)中直接誘導(dǎo)類胚體，由類胚體發(fā)育成完整植株。