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1、四川農(nóng)業(yè)大學博士學位論文大豆MYB轉錄因子基因的克隆及其表達研究姓名：楊文杰申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：楊婉身;唐益雄20070601摘要通過轉錄因子在轉錄水平上調(diào)控目的基因的表達，是植物對其生長發(fā)育及生理代謝調(diào)控的一種重要方式。MYB轉錄因子基因是最大的植物轉錄因子基因家族之一，參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應答，并對細胞分化、細胞周期以及植物葉片等器官的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。大豆是重要的油料作物，同時也是蛋白和異黃酮的重要來源，而大多數(shù)MYB轉錄因子對植物類黃酮的代謝均有調(diào)控作用。因此，本文以大豆為研究材料
2、，從中分離克隆新的MYB轉錄因子基因，以期為MYB轉錄因子在類黃酮的生物合成調(diào)控及其脅迫應答等方面的研究提供一定的理論基礎。主要研究結果如下：1．根據(jù)植物中MYB基因DNA結合域保守區(qū)設計簡并引物，以大豆品種中豆27、吉林3號、淮豆l號及張家口黑豆的葉片為材料，RT-PCR擴增出14個MYB基因同源片段；據(jù)此設計基因特異引物，通過RACE-PCR分離克隆出4個MYB轉錄因子基因，GmMYBZ](D0902862)、GmMYBZ2(D0902861)、GmMYBJd(D0902863)和GmMYBJ7(DQ902864)；氨基酸序列比對表明，這4個基因
3、分別具有兩個MYB結構域，為典型的R2R3MYB轉錄因子基因。2．半定量RT-PCR對這4個基因的組織特異性表達情況進行了檢測，結果只在葉片中檢測到了GmMYBJ6的表達，在莖和葉中分別檢測到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表達，而GmMYBZ2在植物的根、莖、葉及未成熟種子中均有表達。對脅迫應答的檢測結果顯示，在紫外輻射、高鹽及干旱(PEG)條件下，隨著處理時間的增長，GmMYBJ6的表達量增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表達量降低。3．以基因組DNA為模板對GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYRl6和GmMYBJ7進行了PCR擴增，
4、擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，GmMYBZI不含內(nèi)含子，GmMYBZ2含有1個內(nèi)含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分別含有2個內(nèi)含子。4．構建四個酵母效應質(zhì)粒pBridge-GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge,-GmMYBJ6和pBfidge．GmMYRl7，轉入酵母菌株AHl09中，并分別在缺少色氨酸的sD培養(yǎng)基和缺少色氨酸、組氨酸的SD雙缺陷培養(yǎng)基上篩選陽性轉化子。酵母表達表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7均具有明顯的轉錄激活功能，p·半乳糖苷酶活性分別為10．35U、28．48U和24．31U，Wha
5、t-man濾紙顯色反應均能呈現(xiàn)出明顯的藍色；l而GmMYBZl酵母轉化株的13．半乳糖苷酶活性僅為3．59U，Whatman濾紙顯色反應未能呈現(xiàn)出明顯的藍色。5．構建綠色熒光蛋白融合表達載體，基因槍法轉化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，結果表明，C．maMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均定位于細胞核中，與亞細胞定位預測一致。6．構建植物表達載體pCAMBIA2301．GmMYBZ2、pCAMBIA2301一GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，利用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草NC89；通過Kan抗性、Gus染色及RT-PCR篩選鑒定
6、陽性苗；RT-PCR檢測結果顯示，GmMYBJ6可提高類黃酮代謝途徑中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸4．羥化酶(C4H)、4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、黃酮醇合成酶ffLS)等關鍵酶的表達，結果在GmMYBJ6表達的煙草中，總黃酮含量增加；而由于GmMYBZ2和GmMYBJ7抑制了多數(shù)類黃酮代謝途徑中基因的表達，從而導致轉化煙草中總黃酮含量減少。耐脅迫檢測結果表明，GmMYBJ6在煙草中的表達，增強了轉基因煙草對UV-B、高鹽及干旱等非生物脅迫的耐受性。關鍵詞：大豆；MYB轉錄因子；酵母表達；亞細胞定位；類黃酮；轉
7、基因煙草；基因表達調(diào)控ⅡAbstractTranscriptionfactorsplayanimportantroleinregulationofplantgrowthandphysiologicalmetabolismbyregulationofgeneexpressionatthen'anscriptionlevel，MYBtranscriptionfactorgeneisoneofthelargestfamiliesinplants，whichinvolvedinregulationofsecondarymetabolism，respondin
8、gtohormonesandenvironmentalfactors，alsoregulationofcel
