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1、中國(guó)生物工程雜志第23卷第2期JOURNALOFCHINESEBIOTECHNOLOGY2003年2月發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒研究進(jìn)展*曹冬梅韓振海許雪峰(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物研究所北京100094)摘要就發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述和展望。包括Ri質(zhì)粒的特性,轉(zhuǎn)化機(jī)制及轉(zhuǎn)化方法,影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的因素以及發(fā)根農(nóng)桿菌的應(yīng)用。關(guān)鍵詞發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化近二十幾年,隨著高等植物的組織培養(yǎng)以及基發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛根分化為正常因重組技術(shù)的日趨成熟,植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)運(yùn)而植株的分化率高,倍性
2、穩(wěn)定,遺傳穩(wěn)定,并且容易建生。1977年Montoya等首次應(yīng)用Ti質(zhì)粒作為載體成一系列能夠在不同植物細(xì)胞核染色體上插入一[1][5]將TDNA上的農(nóng)桿堿基因轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞,標(biāo)志個(gè)TDNA拷貝的株系?？傊?Ti和Ri兩個(gè)載體著遺傳轉(zhuǎn)化新紀(jì)元的開始。自此以后植物遺傳轉(zhuǎn)系統(tǒng)的日趨完善和互相補(bǔ)充,將會(huì)極大地推動(dòng)基因化技術(shù)逐漸走向成熟并成為研究基因表達(dá)調(diào)控和工程技術(shù)的發(fā)展。應(yīng)用基因工程技術(shù)改良植物品種的基礎(chǔ)技術(shù)。目1發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的特性前用于向植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因的方法和技術(shù)很多,其中包括:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化,外源發(fā)根農(nóng)桿菌是根癌菌屬的
3、一種土壤細(xì)菌,能侵DNA直接導(dǎo)入法(基因槍法,電穿孔法,PEG誘導(dǎo)法染幾乎所有的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物。目等),植物病毒載體系統(tǒng),其中,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)前利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染并得到典型轉(zhuǎn)化性狀的植化方法應(yīng)用最為廣泛,所取得的轉(zhuǎn)基因植株最多,物基本上集中在雙子葉植物近20個(gè)科40個(gè)屬中。尤其是雙子葉植物其最有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法是Ti按照其合成冠癭堿的不同,把Ri質(zhì)粒分為3類:[2]質(zhì)粒載體法。20世紀(jì)80年代以來,在植物細(xì)胞(1)甘露堿型(mannopinetype);(2)黃瓜堿型[6]培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展了一種新的培養(yǎng)系統(tǒng),即Ri(cucumo
4、pintype);(3)農(nóng)桿堿型(agropinetype)。質(zhì)粒載體法,它是由發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子葉植物前兩種類型Ri質(zhì)粒TDNA與農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒TL后,其Ri質(zhì)粒的TDNA片段整合到植物細(xì)胞核基DNA均具有兩個(gè)高度保守區(qū),兩個(gè)保守區(qū)之間的因組中,從而誘導(dǎo)出毛狀根,由毛狀根再生出轉(zhuǎn)基中心區(qū)的同源型堿基序列很少,其中的非同源區(qū)對(duì)[3]因植株,轉(zhuǎn)入的DNA可以傳遞給子代。與Ti質(zhì)根癌的誘導(dǎo)極其重要,尤其是其中的rolB基因?qū)αＯ啾?Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點(diǎn):(1)用Ri質(zhì)粒作誘導(dǎo)根的分化很有效,正由于發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒為基因載體時(shí),不需要解
5、除武裝(disarmed),從其TDNA區(qū)使Ri質(zhì)粒成為把外源目的基因轉(zhuǎn)入植物[7]轉(zhuǎn)化的細(xì)胞上很容易再生植株,即用野生型發(fā)根農(nóng)細(xì)胞,并且插入其核基因組的一個(gè)理想載體。桿菌感染植物可直接再生出完整植株;(2)由發(fā)根一般來說,被侵染的宿主范圍是由Ri質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的毛根來源于同一個(gè)植物細(xì)類型決定的。Ri質(zhì)粒TDNA插入植物細(xì)胞核基[4]胞,因此,毛根的每一個(gè)細(xì)胞都是轉(zhuǎn)化的,這便于因組的長(zhǎng)度與數(shù)目和發(fā)根農(nóng)桿菌的類型有關(guān)。轉(zhuǎn)遺傳操作;(3)Ri質(zhì)粒不含onc基因,對(duì)植株再生無(wú)化體上多個(gè)TDNA插入位置絕大多數(shù)是相互獨(dú)立[8]影響,且再
6、生植株的染色體很少發(fā)生畸變;(4)毛根的,多個(gè)TDNA的插入可能是由于多個(gè)發(fā)根農(nóng)的無(wú)性系可以通過激素的自主性進(jìn)行選擇;(5)由桿菌同時(shí)感染同一個(gè)植物細(xì)胞且其中TDNA均整合到植物細(xì)胞核基因組中,或由一個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌內(nèi)修回日期:20020719若干個(gè)TDNA片段同時(shí)整合到一個(gè)植物細(xì)胞核基*通訊作者,電子信箱:caodm787@sohu.com因組中所致。發(fā)根農(nóng)桿菌的致根性與其所含的Ri第2期曹冬梅等:發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒研究進(jìn)展75[5]質(zhì)粒的類型有密切的關(guān)系,Petit等發(fā)現(xiàn)含農(nóng)桿堿222接種(1)向植物體直接注射法。用活化型Ri
7、質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌有更廣泛的宿主范圍,即好的新鮮菌液對(duì)發(fā)芽后數(shù)日或2周內(nèi)的無(wú)菌幼苗使同一種發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)不同植物或同一植物的不的莖部進(jìn)行2~3次注射接種,2周內(nèi)注射處產(chǎn)生同器官的敏感性也不同。毛狀根。(2)對(duì)植物外植體進(jìn)行接種感染。對(duì)胚軸、子葉、子葉節(jié)、幼葉、未成熟的胚等外植體進(jìn)行2Ri質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化機(jī)制及其轉(zhuǎn)化方法常規(guī)滅菌,用刀片或剪刀切成小塊或小段,用活化21Ri質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化機(jī)制好的菌液進(jìn)行注射涂抹或與菌液共培養(yǎng),然后將外農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是通過體內(nèi)的一段DNA植體置MS培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)毛狀根。(3)與原生質(zhì)轉(zhuǎn)移到被侵染的植物細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。參與影
8、響轉(zhuǎn)體共培養(yǎng)。將葉肉細(xì)胞獲得的原生質(zhì)體培養(yǎng)3~4化侵染的基因位點(diǎn)有(1)被轉(zhuǎn)移DNA,其邊界保守日后,加入100倍量的活化好的菌液進(jìn)行共培養(yǎng),序列為轉(zhuǎn)
