微生物限度和無(wú)菌檢查法驗(yàn)證

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1、微生物限度和無(wú)菌檢查法驗(yàn)證微生物限度和無(wú)菌檢查法驗(yàn)證意義：中國(guó)藥典2000年版及以前的版本雖然收載了微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法，但在如何保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性及檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性方面存在一些問(wèn)題，與國(guó)外藥典的相關(guān)要求比較有一定差距，關(guān)鍵是未明確對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的方法學(xué)驗(yàn)證。以前品種的申報(bào)資料中一般僅提供微生物限度檢查或無(wú)菌檢查的檢查結(jié)果，無(wú)方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容。但從保證藥品安全性的實(shí)際出發(fā)，不同品種需要選擇建立各自適當(dāng)?shù)臋z查方法，即使是仿制藥，由于不同生產(chǎn)企業(yè)采用的工藝、輔料等的不同，其產(chǎn)品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性，進(jìn)行微生物限度檢查或無(wú)菌檢查時(shí)，具體的檢查方法也不能

2、簡(jiǎn)單地照搬，需要通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證核實(shí)已有的試驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)是否適用，因此，也需要進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。中國(guó)藥典2005年版對(duì)微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法進(jìn)行了修訂完善，明確規(guī)定進(jìn)行藥微生物限度和無(wú)菌檢查法驗(yàn)證目的是確認(rèn)試驗(yàn)中應(yīng)選擇藥典收載的何種供試液制備方法、何種測(cè)定方法，以及驗(yàn)證確定的檢測(cè)系統(tǒng)是否適用于該藥品的檢驗(yàn)。如果供試品有抑菌性，影響測(cè)定結(jié)果，則應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ┰囈旱囊志钚院笤龠M(jìn)行檢查。也就是說(shuō)，只有通過(guò)方法驗(yàn)證，才能確定針對(duì)具體品種的具體的檢驗(yàn)方法，保證采用的方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法驗(yàn)證的思路首先了解供試品是否有抑菌性、抑何種菌，再考

3、慮選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蚪档凸┰嚻返囊志?，然后用試?yàn)驗(yàn)證所采用的方法已經(jīng)消除了抑菌性（能使人工加入的各種試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好），特別是能滿(mǎn)足對(duì)產(chǎn)品最敏感菌的生長(zhǎng)；最后將所作的試驗(yàn)記錄在案，形成確認(rèn)該供試品在該檢驗(yàn)量及該檢驗(yàn)條件下，已充分消除抑菌性，能確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的驗(yàn)證報(bào)告。微生物限度和無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)可概括描述為：在采用的檢驗(yàn)方法和過(guò)程中，通過(guò)分別加入規(guī)定量的代表性微生物，以驗(yàn)證供試品是否在規(guī)定的檢驗(yàn)量、在所采用的檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作系統(tǒng)中可能對(duì)微生物生長(zhǎng)有影響的各種因素），并且所用方法對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)不良影響，從而

4、確認(rèn)檢驗(yàn)方法的有效性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明，保證其對(duì)結(jié)果的判斷沒(méi)有影響。方法驗(yàn)證的重點(diǎn)1、驗(yàn)證制成適宜供試液的前處理方法，證明方法對(duì)微生物生長(zhǎng)、檢出無(wú)影響。2、驗(yàn)證樣品有無(wú)抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那一個(gè)？其結(jié)果將直接影響后續(xù)檢驗(yàn)方法的選擇和操作步驟的進(jìn)行，同時(shí)是最終所選檢驗(yàn)方法和操作步驟合理性的證明。3、驗(yàn)證消除樣品抑菌性的方法，證明方法的有效性及方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)無(wú)影響；如何選擇合理、適宜、簡(jiǎn)單有效的消除抑菌性的方法是當(dāng)前驗(yàn)證工作的關(guān)鍵。方法驗(yàn)證的步驟與內(nèi)容1、制備驗(yàn)證試驗(yàn)用菌液按藥典無(wú)菌檢查法中培養(yǎng)基靈敏度

5、檢查項(xiàng)中試驗(yàn)用菌液的制備方法將規(guī)定需用的試驗(yàn)菌分別制成每毫升中含10～100個(gè)菌（CFU）的供試菌液。2、樣品的前處理方法樣品的前處理方法是驗(yàn)證試驗(yàn)的一部分，需證明所用的處理方法對(duì)各試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)無(wú)影響。根據(jù)供試品的性狀，選用以下適宜的方法，或幾種方法聯(lián)合使用：溶解：驗(yàn)證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)無(wú)影響。乳化：驗(yàn)證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對(duì)微生物的生長(zhǎng)無(wú)影響。破乳：驗(yàn)證所用破乳劑的有效性、使用量及對(duì)微生物的生長(zhǎng)無(wú)影響。萃?。候?yàn)證有機(jī)相選擇的合理性、有效性及對(duì)微生物的生長(zhǎng)無(wú)影響。稀釋?zhuān)候?yàn)證降低供試品相對(duì)抑菌濃度的有效稀

6、釋倍數(shù)。離心：驗(yàn)證所用轉(zhuǎn)速、時(shí)間和微生物的分布情況。應(yīng)說(shuō)明采取某種前處理方法的原因，如樣品不需要特別的前處理就能制成均勻的供試液，這一步可以省掉，直接進(jìn)入確定樣品有無(wú)抑菌性的步驟。確定供試品是否有抑菌性、抑什么菌？通過(guò)文獻(xiàn)資料或申報(bào)資料中的藥效學(xué)資料，了解其對(duì)不同細(xì)菌的MIC，參考已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的品種、抗菌藥物可根據(jù)抗菌譜確定敏感菌、中成藥抗菌譜不清楚，至少需選擇一株細(xì)菌和一株真菌來(lái)試驗(yàn)。也可以直接通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)確定抑菌性。試驗(yàn)確定抑菌性的方法：在規(guī)定量的供試液中加入試驗(yàn)用微生物10～100個(gè)，如微生物生長(zhǎng)良好，說(shuō)明供試品對(duì)該種微生物無(wú)抑菌活性。如已用藥典規(guī)定

7、的各試驗(yàn)菌進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果均能生長(zhǎng)良好，說(shuō)明供試品無(wú)抑菌性，可用常規(guī)方法檢驗(yàn)。如加入的微生物不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明供試品有抑菌性；如加入的微生物中有某一種菌最不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛴行Ы档凸┰嚻返囊志?根據(jù)供試品的特性選擇藥典規(guī)定的消除其抑菌性的方法（一種或幾種方法聯(lián)合），或根據(jù)藥物的化學(xué)特性，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑；并通過(guò)模擬試驗(yàn)（驗(yàn)證試驗(yàn)）對(duì)消除或降低抑菌性的效果進(jìn)行檢驗(yàn)。無(wú)菌檢查可采用：①薄膜過(guò)濾法；②中和法（目前藥典僅收載β-內(nèi)酰胺酶處理法）。①薄膜過(guò)濾法適用于液體供試品和可溶

8、于水的固體供試品（只要許