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《微生物生態(tài)學(xué)-11基因工程菌的標(biāo)記與跟蹤》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、基因工程菌株的標(biāo)記與跟蹤GFP基因1、綠色熒光蛋白的來源熒光現(xiàn)象在許多海洋無脊椎動物中普遍存在著。許多刺胞亞門的動物(綠色熒光)和幾乎所有櫛水母類的動物(藍(lán)色熒光)在受到刺激時都可以發(fā)出熒光。1962年,Shimomura和Johnson等人首先從水螅水母類動物AequoreaVictoria中分離、純化出一種熒光物質(zhì),稱為綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProteins,GFPs)。目前研究得較為深入的是來自多管水母科(Aequorea)和海紫羅蘭科(Renilla)的熒光蛋白,即AequoreaGFP和RenillaGFP(A-G
2、FP和R-GFP)。2、GFP的特性:A-GFP是球狀的蛋白質(zhì),分子量為27-30KDa的單體,最高吸收峰為395nm,肩峰為473nm,發(fā)射光譜是λmax=508-509nm。生色團的形成首先是Gly67的氨基對Ser65的羰基親核進攻而環(huán)化成五元環(huán),同時失去一分子水形成咪唑基。在有氧條件下,新的N=C雙鍵促進Tyr66的α、β-氧化脫氫,從而形成一個連續(xù)的π電子芳香族系統(tǒng)-生色團。GFP生色團形成示意圖(3和4表示不同pH條件下的兩種形式,4和5是同分異構(gòu)體)成生色團。3熒光特性首先,僅以藍(lán)光或紫外光照射GFP就能激發(fā)其熒光,并不需要外加任何底
3、物或共作用因子;熒光穩(wěn)定,不易衰退,只有在過熱(>65℃)、過酸(pH<4)、過堿(pH12-13)或其它變性劑(如6M胍基鹽酸)存在的條件下GFP才會變性,熒光消失。當(dāng)變性條件去除后,49%-90%以上的蛋白質(zhì)能夠很快復(fù)性。更重要的是,它們在很大的pH范圍內(nèi)(pH7-12.2)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。GFP基因的表達并沒有物種、細(xì)胞種類、位置的限制,而且GFP不論在真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞中表達后,在藍(lán)光照射下都能產(chǎn)生強烈熒光。4、綠色熒光蛋白的優(yōu)缺點GFP是迄今為止唯一一種活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。(1)GFP的優(yōu)點
4、:檢測方便:因為GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物、酶或其它共反應(yīng)因子,GFP發(fā)射的熒光用肉眼或熒光顯微鏡就可以檢測到,不會損傷正在生長的細(xì)胞和組織。熒光穩(wěn)定:GFP對光致漂白作用有強烈的耐受性,能耐受長時間光照,從而延長了可探測時間。無毒害:GFP對生活細(xì)胞基本無毒害。共用性和通用性:GFP的表達幾乎沒有受體范圍的限制,在原核和真核生物中都獲得了成功的表達,是一種在生物界較為“通用”的基因。其次,因為GFP較小,只含有238個氨基酸,編碼GFP的基因序列也較短,所以它可以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒,而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。(2)GFP的
5、缺點:正因為其熒光反應(yīng)不是酶反應(yīng),所以GFP的檢測不是很靈敏,而且不易對其熒光進行定量測定。GFP基因的表達可能有假象存在:細(xì)胞本身存在一些可以受光激發(fā)的物質(zhì),能產(chǎn)生一定量熒光。5、GFP的用途:(1)GFP基因可以作為遺傳標(biāo)記和報告基因;(2)GFP可用作定位標(biāo)記;GFP標(biāo)記降解菌的生態(tài)學(xué)研究DLL-1菌啟動子的篩選和GFP標(biāo)記載體的構(gòu)建DLL-1總DNAA:λ-DNA/HindⅢmarkerB-D:ThetotalDNAofDLL-1DLL-1總DNA的酶切A:DLL-2000markerB:ThetotalDNAofDLL-1C-E:Sau3
6、AⅠdigestionofDLL-1甲基對硫磷降解菌DLL-1的GFP發(fā)光基因標(biāo)記質(zhì)粒基因文庫質(zhì)量檢測V:λ-DNA/HindⅢmarkerU:pRobe-GFPA~T:theplasmidsofthewhitecolony基因組文庫的質(zhì)量檢測從以上的質(zhì)粒電泳均可斷定外源片段的插入率為90%。說明所建文庫是高質(zhì)量的,足以滿足普通基因文庫的構(gòu)建工作。在紫外燈下發(fā)光的綠色菌落啟動子的篩選GFP標(biāo)記載體的構(gòu)建45號陽性克隆pIJGFP-45pTRGFP-45pBBRGFP-45GFP標(biāo)記載體的構(gòu)建45陽性克隆pIJGFP-45pTRGFP-45pBBRG
7、FP-45(10倍功率)用新構(gòu)建的標(biāo)記載體對甲基對硫磷降解菌DLL-1進行GFP發(fā)光基因標(biāo)記菌落在紫外燈下的發(fā)光檢測(LB)A:DLLBR-45B:DLL-1菌落在紫外燈下的發(fā)光檢測(LB)A:DLL-1B:DLLTR-45pBBRGFP-45pTRGFP-45DLL-1的標(biāo)記與驗證DLLBR-45的激光共聚焦顯微鏡熒光單細(xì)胞照片及熒光強度分析DLLTR-45的激光共聚焦顯微鏡熒光單細(xì)胞照片及熒光強度分析pBBRGFP-45pTRGFP-45(33倍功率)甲基對硫磷降解的紫外掃描圖譜CK(箭頭所指)2.TreatmentDLL-1(黑線)3.Tre
8、atmentDLLBR-45(紅線)標(biāo)記前后的性狀比較降解性狀的比較GFP基因標(biāo)記的甲基對硫磷降解菌DLLBR-45在土壤