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1、基因工程菌大腸桿菌2被選為基因工程菌的原因常見易得,易于培養(yǎng)質(zhì)粒為常用運(yùn)載體代謝迅速,經(jīng)濟(jì)高效基因工程菌的通性3作為表達(dá)外源基因受體菌的優(yōu)劣比較劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)霉素優(yōu)勢基因克隆表達(dá)系統(tǒng)完善全基因組測序,共有4405個(gè)開放型閱讀框架繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物4工程菌高密度發(fā)酵工藝自重組DNA技術(shù)產(chǎn)生以來,許多在臨床上具有重要治療價(jià)值的蛋白藥物通過攜帶有目的基因的大腸桿菌成功地在實(shí)驗(yàn)
2、室和工廠得以生產(chǎn)。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝,生物工程菌發(fā)酵的目的是希望能狄得大量的外源基因產(chǎn)物,盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表達(dá)不僅涉及宿主、載體和目的基因二者之間的相互關(guān)系,而且與其所處環(huán)境條件息息相關(guān),因此僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,需要對影響外源基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析,探索出適合外源基因表達(dá)的發(fā)酵工藝。高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)是近幾年發(fā)酵工業(yè)的目標(biāo)和方向。對于大腸桿菌,尤其是重組大腸桿菌的發(fā)酵來講,實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵,可相應(yīng)的縮小生物反應(yīng)器的體積和降低生物量的分離費(fèi)用
3、,從而降低生產(chǎn)成本,達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的。通過對基因工程菌(RRhPI-pQE40E.coliM15)發(fā)酵條件的優(yōu)化,可以看出搖床轉(zhuǎn)速與補(bǔ)料方式對發(fā)酵結(jié)果影響最大.搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵過程中氧氣的供給有很大的關(guān)系。大腸桿菌的生長代謝需要氧氣的參與,溶解氧濃度對菌體的生長及重組產(chǎn)物的影響很大,溶解氧的濃度過高或過低都會影響大腸桿菌的代謝,使后期生長變得極為緩慢,而且會降低重組蛋白的表達(dá)量.菌體在進(jìn)行大量的增殖過程中,消耗氧進(jìn)行氧化分解代謝,因而飽和氧的及時(shí)供給非常重要。隨著發(fā)酵的進(jìn)行菌體的細(xì)胞密度迅速增加,溶解氧的濃度因不斷被菌體消耗而降低,細(xì)胞的生長
4、開始減慢,ST值下降,尤其在發(fā)酵后期,下降幅度更大。在高密度發(fā)酵后期,由于菌體密度的擴(kuò)增,耗氧量極大,發(fā)酵罐的各項(xiàng)物理參數(shù)均不能滿足對氧的供給,結(jié)果導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)量很低。所以維持較高水平的溶氧濃度能提高帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的生長繁殖,有利于外源基因的重組蛋白的表達(dá)。一般的高密度發(fā)酵的通風(fēng)速度達(dá)到18L/min(20L發(fā)酵罐),攪拌速度達(dá)到500rpm以上,往往還需要供給純氧,需保持60%以上的溶氧飽和度,這樣才能提高帶有重組質(zhì)粒細(xì)胞的生長,利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。需要注意的是,要考慮通風(fēng)速度和攪拌速度的增加對泡沫的產(chǎn)生和發(fā)酵液粘稠度的影響,
5、需要在培養(yǎng)基中加入適宜的消泡劑。酵母菌6傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)先使纖維素酶基因與表達(dá)載體相結(jié)合,再將重組體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)形成轉(zhuǎn)化子,表達(dá)目的基因,從而產(chǎn)生纖維素酶蛋白,這是傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前有2種方法可以使酵母細(xì)胞攝取外源DNA,即原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化。現(xiàn)在采用較多的是完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法,該方法是1983年發(fā)展起來的。此方法雖然要用Li離子處理細(xì)胞,但和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法相比,則比較簡單,在篩選轉(zhuǎn)化子時(shí),不必進(jìn)行細(xì)胞壁再生,而且Li離子處理完整酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體的高。但必須用聚乙二醇處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞,否則轉(zhuǎn)化率會大幅度下降。97/3/202
6、1酵母表面展示系統(tǒng)7/3/202111酵母表面展示系統(tǒng)的類型目前,最常見的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括:凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)。凝集素展示表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號肽下游,融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后,信號肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌,由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號的凝集素多肽序列,可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中,從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合,并將融合蛋白展露表達(dá)在細(xì)胞表面,此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子系統(tǒng):GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨
7、定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號錨定外源蛋白,此系統(tǒng)與凝集素展示相似;絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合,通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。酵母表面展示與酶技術(shù)酶的固定化是指借助物理或者化學(xué)方法將酶固定于特殊的相,使得酶與整體流體分開,但是仍然能夠進(jìn)行底物和效應(yīng)物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種技術(shù)。與游離酶相比,固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性,并使酶能夠反復(fù)回收利用。但是,傳統(tǒng)的固定化方法也會產(chǎn)生一些不利因素,例如由于增加固定
8、化操作,導(dǎo)致酶固定化過程中的活性收率損失;另外由于固定化操作需用載體,因而增加了載體成本費(fèi)和固定化操作費(fèi)用。酵母表面展示與酶技術(shù)利用表面