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《蛋白質(zhì)的分離純化和表征》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、蛋白質(zhì)的 分離純化和表征◆一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)◆二、蛋白質(zhì)分子的大小和空間結(jié)構(gòu)◆三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀◆四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則◆五、蛋白質(zhì)的分離純化方法◆六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子的大小和空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子量很大，相對(duì)分子量變化范圍在6000-1000000或更大一些。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法：1.根據(jù)蛋白質(zhì)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量2.滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子量3.蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)4.沉降分析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量5.凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子量6.SDS聚丙烯酰
2、胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子量蛋白質(zhì)有四級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈中各種氨基酸相互聯(lián)接的順序是蛋白質(zhì)的初級(jí)結(jié)構(gòu)，也叫一級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，通過(guò)氫鍵，形成有規(guī)則的構(gòu)象，這稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)。α-螺旋β-折疊無(wú)規(guī)線團(tuán)在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈間通過(guò)氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用而進(jìn)行盤旋和折疊，因而產(chǎn)生的特定的三維空間結(jié)構(gòu)，這稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)，也稱為蛋白質(zhì)的亞基。各個(gè)亞基在低聚蛋白中的空間排布及相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生理活性是由二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)決定的。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與 蛋白質(zhì)的沉淀◇（1）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)◇（2
3、）蛋白質(zhì)的沉淀分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需要具備3個(gè)條件：第一，分散相的質(zhì)點(diǎn)大小在1～100nm范圍內(nèi)，這樣大小的質(zhì)點(diǎn)在動(dòng)力學(xué)上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對(duì)這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中作不斷的布朗運(yùn)動(dòng)(Brownmovement)；第二，分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種凈電荷，互相排斥，不易聚集成大顆而沉淀；第三，分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層(hydrationmantle)，質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。（1）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種親水膠
4、體，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)，如一NH2，-COOH,-OH以及–CO-NH-等，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質(zhì)分子表面形成一個(gè)水化層，每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合0.3～0.5克水。蛋白質(zhì)分子表面上的可解離基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)膒H條下．都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層——雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當(dāng)穩(wěn)定的，如無(wú)外界因素的影響，就不致互相凝集而沉淀。蛋白質(zhì)溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過(guò)半透膜。（2）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)在溶液中的
5、穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性既然與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷和水化作用有關(guān)，那么很自然，任何影響這些條件的因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性?！篼}析法◇有機(jī)溶劑沉淀法◇重金屬鹽沉淀法◇生物堿試劑和某些酸類沉淀法◇加熱變性沉淀法鹽析法鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后，復(fù)可溶解。有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇或丙酮
6、等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時(shí)間則可使變性速度減慢。重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救就是因?yàn)樗芎椭亟饘匐x子形成不溶性鹽，然后再服用催吐劑排出體外。重金屬鹽常能使蛋白質(zhì)變性，這可能是因?yàn)橹亟饘冫}水解生成酸或堿的緣故。生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿
7、沉淀的一類試劑，如驟酸也稱單寧酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當(dāng)溶液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗(yàn)部門用來(lái)除去體液中干擾測(cè)定的蛋白質(zhì)。加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時(shí)由于
8、蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)也破壞了帶電狀態(tài)。我國(guó)很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點(diǎn)入少量鹽鹵（含MgCl2)的制豆腐的方法，這是成功的應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)的一個(gè)例子。四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則◇1.前處理◇2.粗分級(jí)分離◇3.細(xì)分級(jí)分離動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織；種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的
