蛋白質(zhì)分分離純化和表征

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1、第七章蛋白質(zhì)的分離純化和表征一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測(cè)定三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則六、蛋白質(zhì)的分離純化方法七、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子中有很多酸性和堿性解離基團(tuán)，是具有兩性解離性質(zhì)的化合物。各種解離基團(tuán)的解離度與溶液的pH有關(guān)，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質(zhì)分子帶正電荷越多，負(fù)電荷越少；pH升高，則解離情況相反。等電點(diǎn)（pI）:在特定pH條件下，某種蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等，靜電荷為零，這一pH稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。幾種蛋

2、白質(zhì)等電點(diǎn)等電pH并不是一個(gè)恒定的值，它會(huì)因溶液中鹽的種類(lèi)和離子強(qiáng)度的影響而有所不同。等離子點(diǎn)(isoionicpiont):蛋白質(zhì)在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒(méi)有其他離子干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來(lái)決定，這種條件下的等電點(diǎn)稱(chēng)為等離子點(diǎn)。等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量的范圍：6×103～1×106Da。（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量用化學(xué)分析方法測(cè)出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量。并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中含有一個(gè)被測(cè)元素的原子，則可由此計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0

3、.335%,計(jì)算二者的相對(duì)分子質(zhì)量。最低相對(duì)分子量＝x100=鐵的百分含量鐵的原子量0.33555.8x100=16700測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的原理和方法也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原理計(jì)算蛋白質(zhì)的最低分子量。（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子量滲透壓法測(cè)定Mr操作簡(jiǎn)單，Mr在10-100kDa時(shí)較準(zhǔn)，但不能區(qū)別蛋白質(zhì)分子是否均一。滲透壓公式：Mr=RTlimc→0πc(c=質(zhì)量濃度，g/mol)滲透壓法測(cè)定Mr法的缺點(diǎn)：不能確定溶液蛋白質(zhì)分子是否均一。（三）沉降分析測(cè)定Mr在強(qiáng)大的離心場(chǎng)中，如果蛋白質(zhì)溶液的密度大于溶液密度，溶液

4、中的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉降。沉降速度決定于蛋白質(zhì)的分子量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。沉降系數(shù)（Ｓ20,w）：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)的沉降速度。定義1Ｓ＝10-13秒（斯維得貝格單位）。Mr=RTS÷D(1－Vρ)沉降速度法其中:S:是沉降系數(shù)D:是擴(kuò)散系數(shù)ρ:是溶劑的密度v:是蛋白質(zhì)的偏微分比容。將純的分析樣品放于離心池中，進(jìn)行低速度長(zhǎng)時(shí)間離心，樣品顆粒沉降形成濃度差，而擴(kuò)散又使樣品顆粒由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴(kuò)散,最終達(dá)到沉降與擴(kuò)散的平衡狀態(tài)。Mr=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]沉降平衡法（四）凝膠過(guò)濾法

5、測(cè)定Mr凝膠過(guò)濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，同時(shí)可以測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve（Ve為洗脫體積），并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測(cè)V測(cè)（五）SDS-PAGE法測(cè)定Mr聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身

6、而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí)，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis1．蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)顆粒大小屬于膠體粒子的

7、范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個(gè)因素：雙電層水化層a.丁達(dá)爾效應(yīng)b.布朗運(yùn)動(dòng)c.不能透過(guò)半透膜三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀2．蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用。①鹽析法（saltingout）：中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白質(zhì)脫去水化層。優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性。鹽溶（saltin

8、gin）：稀鹽溶液中蛋白質(zhì)溶解度增加的現(xiàn)象。②有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）→脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用。條件：低溫操作，縮短時(shí)間。③重金屬鹽沉淀法：當(dāng)溶