蛋白質(zhì)的分離純化和表征

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1、第六章蛋白質(zhì)的分離純化和表征一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)1.蛋白質(zhì)的酸堿性蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)，溶液的pH可以改變蛋白質(zhì)的帶電情況。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（等離子點(diǎn)）受組成蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸數(shù)目的影響。2.蛋白質(zhì)的大分子特性a滲透與滲透壓溶劑分子由稀溶液向濃溶液?jiǎn)畏矫娴膬粢苿?dòng)稱為稱為滲透。滲透壓是溶液分子在平衡濃度時(shí)的凈水壓，是蛋白質(zhì)的依數(shù)性之一。b蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散現(xiàn)象由于濃度差導(dǎo)致的溶質(zhì)分子的凈遷移，稱為擴(kuò)散。擴(kuò)散系數(shù)的大小與蛋白質(zhì)形狀、大小及溶劑的粘度有關(guān)。c蛋白質(zhì)分子的沉降特性蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象稱為沉降。沉降的速度與蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、密度及溶劑

2、的密度和粘度、溫度等有關(guān)。沉降系數(shù)用S做單位。d蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)及沉淀分散相質(zhì)點(diǎn)的半徑介于1-100nm時(shí)形成的均勻分散的溶液，稱為膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液作為膠體溶液，穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)分子表面的水化層和雙電層。沉淀蛋白質(zhì)的方法：大量的中性鹽、極性有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑、加熱二、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾2.密度梯度離心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度3.凝膠過濾層析(分子排阻層析)分離蛋白質(zhì)常用的凝膠的商品名：Sephadex某一蛋白質(zhì)樣品在凝膠柱上的分配系數(shù)Kav=Ve:該蛋白質(zhì)的洗脫體積Vo:凝膠柱的空隙體積(外水體積)Vt:凝膠柱的總體積V

3、e－VoVt－Vo凝膠過濾層析原理示意圖（二）利用溶解度差別純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的溶解度受到溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等因素的影響，所以改變以上條件，可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。1.通過改變?nèi)芤簆H值的等電點(diǎn)沉淀法2.通過改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度的鹽析、鹽溶3.有機(jī)溶劑的分級(jí)沉淀4.通過改變溫度的沉淀法（三）根據(jù)電荷不同純化蛋白質(zhì)1.電泳紙電泳或薄膜電泳粉末電泳細(xì)絲電泳凝膠電泳平板電泳柱狀電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)濃縮膠樣品分離膠在PAGE中，除了一般的電荷效應(yīng)外，還有凝膠對(duì)樣品的分子篩效應(yīng)和濃

4、縮效應(yīng)，三種效應(yīng)共同起作用，使樣品的分離效果大大提高。（2）等電聚焦電泳(IEF-PAGE)Ph=3pH=10連續(xù)pH梯度的凝膠和樣品電泳兩性電解質(zhì)載體ampholite（3）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在SDS和少量的巰基乙醇存在時(shí)，蛋白質(zhì)分子解聚并處于完全展開的狀態(tài)，SDS以其烴基鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基相當(dāng)于結(jié)合一個(gè)SDS分子，使得蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移率完全取決于相對(duì)分子量而同本身所帶的電荷及形狀無關(guān)。2.離子交換層析纖維素離子交換層析交鏈葡聚糖離子交換層析（三）根據(jù)對(duì)配基的生物學(xué)特性的分離：親和層析親和層析是利用生物親和力，即蛋白

5、質(zhì)分子和其配基之間特有的識(shí)別能力而建立的一種純化方法。三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法1.根據(jù)化學(xué)組成測(cè)最低相對(duì)分子量2.由滲透壓測(cè)相對(duì)分子量3.沉降分析法測(cè)相對(duì)分子量沉降速度法：蛋白質(zhì)分子在離心力作用下沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)，產(chǎn)生沉降界面，通過測(cè)定界面的移動(dòng)速度求出蛋白質(zhì)的分子量。沉降平衡法：蛋白質(zhì)在高速離心力作用下逐漸沉降，直至其浮力與離心力相等時(shí)為止。4.凝膠過濾法測(cè)相對(duì)分子量在一定的分子量范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子量M的對(duì)數(shù)和洗脫體積成線性關(guān)系：logM=K1-K2Ve5.SDS-PAGE測(cè)相對(duì)分子量lgM=K1－K2μR