《電泳技術(shù)》PPT課件

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1、第四章電泳技術(shù)目錄第一節(jié)基本原理第二節(jié)電泳的分類第三節(jié)??醋酸纖維素薄膜電泳第四節(jié)瓊脂糖凝膠電泳第五節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳第六節(jié)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子第一節(jié)基本原理遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下泳動的速度，可用下列公式計算：Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/VtＵ為遷移率（cm2·V-1·min-1）；υ為顆粒泳動速度（cm·s-1）；E為電場強(qiáng)度（V·cm-1）；d為顆粒泳

2、動的距離（cm）；l為濾紙有效長度（cm）；V為實(shí)際電壓（V）；t為通電時間（s或min）。通過測量d,l,V,t,即可計算出被分離物質(zhì)的遷移率。1遷移率單位=10-5cm2·V-1·min-1在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的化學(xué)特征常數(shù)顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快，反之則泳動速度慢。遷移率還與分子的形狀，介質(zhì)粘度，顆粒所帶電荷有關(guān)，遷移率與顆表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑成反比。影響電泳速度的外界因素1.電場強(qiáng)度2.溶液的pH值3.溶液的離子強(qiáng)度4.電滲現(xiàn)

3、象5.溫度的影響6.支持物的影響影響電泳速度的外界因素1.電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動速度越快。影響電泳速度的外界因素2．溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。影響電泳速度的外界因素3.溶液的離子強(qiáng)度電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，相成一個與運(yùn)動粒子符號相反的離子氛（ionicatmosphere），它

4、使該離子向相反的方向運(yùn)動，從而降低了該粒子的遷移率。離子的這種阻礙效應(yīng)是與其濃度和價數(shù)相關(guān)的。用離子強(qiáng)度來表示，它的數(shù)值如下式：式中s表示共有s種離子，Ci和Zi分別代表每種離子的濃度（mol/L）和價數(shù)。影響電泳速度的外界因素4.電滲現(xiàn)象一個U形管的底部裝上一塊素?zé)砂澹芊猓?管中裝入液體，并在兩端加入電極通電，就會看到負(fù)極的液面上升。因?yàn)榇砂鍘в胸?fù)電荷，液體相對地帶有正電荷，因而向負(fù)極移動。這種液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象。影響電泳速度的外界因素5.溫度的影響電泳過程中由于通

5、電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置影響電泳速度的外界因素6.支持物的影響對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜無法重復(fù)。第二節(jié)電泳的分類一、按分離原理分類二、按有無固體支持物分類電泳的分類一、按分離原理分類區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳聚焦電泳四種電泳的分類二、按有無固體支持物分類第三節(jié)醋酸纖維素薄膜電泳一、原理以醋酸纖維素薄膜為支持物。二、材料和試

6、劑三、特點(diǎn)特點(diǎn)：１電泳后區(qū)帶界限清晰；２通電時間較短；３它對各種蛋白質(zhì)幾乎完全不吸附，因此無拖尾現(xiàn)象；４靈敏度高，樣品用量少。５對染料也沒有吸附。６它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果。醋酸纖維素膜電泳槽可做各種醋酸纖維素膜電泳、紙電泳及載玻片電泳等。第四節(jié)　凝膠電泳瓊脂糖、聚丙稀酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖凝膠電泳一般用低濃度的溴化乙錠染色，聚丙稀酰胺凝膠電泳一般用硝酸銀染色，以確定DNA在凝膠中的位置。1～10ng的DNA就可以檢測出。瓊脂糖和聚丙稀酰胺凝膠可以制

7、備成各種形狀、大小和孔隙度，并在各種裝置中進(jìn)行電泳。聚丙稀酰胺凝膠的分辨率可以達(dá)到1bp。一般在垂直裝置下使用。瓊脂糖凝膠電泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝膠，但其分離范圍較廣。一般在水平裝置下使用。瓊脂糖凝膠電泳主要用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等，為DNA分子及其片段分子量測定和DNA分子構(gòu)象的分析提供了重要手段。影響瓊脂糖凝膠在DNA遷移速率的因素DNA分子的大小瓊脂糖的濃度DNA的構(gòu)象所加電壓電場方向堿基組成與溫度嵌入染料的存在電泳緩沖液的成分DNA分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系

8、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系共價閉環(huán)cccDNA>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本操作１、配制緩沖液貯備液２、水平型瓊脂糖凝膠制備３、樣品的制備與點(diǎn)樣４、電泳５、染色６、樣品回收橋式水平電泳槽用于對DNA、蛋白的鑒定、分離、制備及分子量測定DNA回收電泳槽用于電洗脫回收DNA微型水平電泳槽用于對DNA、蛋白的鑒定、分離、制備及分子量測定1kbDNAladderAnagarosegelwi