生化技術(shù)電泳技術(shù)ppt課件.ppt

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1、第三章電泳技術(shù)電泳（electrophoresis簡(jiǎn)稱EP）是指帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的想象。一、基本原理㈠不同的帶電質(zhì)粒在相同電泳條件下，質(zhì)粒移動(dòng)速度與質(zhì)粒所帶凈電量呈正比而與質(zhì)粒的大小呈反比，即質(zhì)粒帶電荷越多在電場(chǎng)中移動(dòng)速度越快，質(zhì)粒的體積或分子量越大移動(dòng)速度越慢。當(dāng)電泳到一定時(shí)間后停止電泳，不同的質(zhì)粒會(huì)集中到相應(yīng)的位置形成一條條的分離區(qū)帶，將不同物質(zhì)分離開來。如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核酸、激素等兩性物質(zhì)溶液，由于不同它們的等電點(diǎn)和分子量是不同的，電泳后形成不同的區(qū)帶，利用此性

2、質(zhì)把混合物分離開來。㈡不同的物質(zhì)由于其帶電性質(zhì)，顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，因此可使它們分離開。如蛋白質(zhì)分子，在PH=PI時(shí)，正負(fù)電荷相等，凈電荷為零，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不移動(dòng)；若PH＜PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)；若PH＞PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷則向正極移動(dòng)。㈢帶電質(zhì)粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度取決于帶電的多少和分子的大小。二、影響泳動(dòng)速度的主要因素：在一定的條件下，任何帶電顆粒都具有自己的特定泳動(dòng)速度，影響泳動(dòng)速度的因素有顆粒的性質(zhì)、電場(chǎng)強(qiáng)度和溶液的性質(zhì)等。1、顆粒的

3、性質(zhì)：即顆粒的直徑、形狀以及所帶的凈電荷量。2、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)速度起到十分重要的作用，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒的移動(dòng)速度越快。反之，則越慢。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度的大小將電泳分為常壓電泳和高壓電泳。常壓電泳：多用于蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的電泳分離。高壓電泳：多用于氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì)的電泳分離。3、溶液性質(zhì)（1）溶液的PH值溶液的PH值決定帶電顆粒的解離度，也即決定其帶凈電荷的數(shù)量。對(duì)蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，溶液的PH值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則其所帶的凈電荷量越多，在電場(chǎng)中移動(dòng)速度越快。因此分離某混合兩性電

4、解質(zhì)物質(zhì)時(shí)，應(yīng)選擇一個(gè)合適的PH，使各物質(zhì)所帶的凈電荷量差異大些以利于分離。（2）溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度越高，質(zhì)粒的泳動(dòng)速度越慢，但電泳的區(qū)帶卻較清晰，反之則越快，分離度亦較差。離子強(qiáng)度表示所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，即取決于離子電荷的總數(shù)。原因是：1）若離子強(qiáng)度過高，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在周圍形成離子擴(kuò)散，這種靜電引力導(dǎo)致顆粒泳動(dòng)度降低。2）若離子強(qiáng)度過低，溶液的緩沖能力差，不能維持溶液的PH值，改變顆粒泳動(dòng)速度因此，電泳時(shí)溶液的離子強(qiáng)度一般為0.02~

5、0.2之間，電泳較為合適。（3）溶液的粘度溶液的粘度與泳動(dòng)度成反比關(guān)系，粘度過大或過小，必然影響泳動(dòng)度4、電滲溶液在電場(chǎng)的作用下，對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。1）若支持物帶有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠支持物的溶液相對(duì)帶正電，在電場(chǎng)作用下，此溶液層向負(fù)極移動(dòng)。2）若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，使靠支持物的溶液相對(duì)帶負(fù)電，在電場(chǎng)作用下，此溶液層向正極移動(dòng)。---------++++++負(fù)極A支持物溶液的離子+++++++----------正極B支持物溶液的離子當(dāng)

6、顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向相反時(shí)，則降低顆粒的泳動(dòng)速度。三、電泳的種類（一）按有無固體支持物分1、顯微電泳2、自由界面電泳是用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過程。主要用于研究膜結(jié)構(gòu)以及癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性等方面。自由界面電泳是膠體溶液的溶質(zhì)顆粒經(jīng)過電泳后，在膠體溶液和溶劑之間形成界面的電泳過程。在U型管中加入一定量的帶色膠體溶液，分別在U型管兩端加入等量的緩沖液，兩端通直流電，一段時(shí)間后會(huì)看見一邊膠體溶液的界面上升而另一邊界面下降。下行界

7、面上行界面緩沖液緩沖液膠體溶液3、區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳是樣品物質(zhì)在支持物上進(jìn)行電泳的過程，各個(gè)組分因泳動(dòng)速度的不同而形成不同的帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。如紙電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳、淀粉凝膠電泳等。（二）按凝膠濃度不同分分為不連續(xù)緩沖系統(tǒng)電泳（如圓盤狀凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）、凝膠濃度梯度電泳、連續(xù)電泳（如等電聚焦電泳）（三）按電泳槽的種類分有水平平板電泳、垂直平板電泳、圓盤電泳（四）按電泳原理和方式分單向電泳、雙向電泳、等電聚焦電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、

8、免疫電泳。圓盤電泳垂直平板電泳標(biāo)準(zhǔn)樣品四、電泳常用的支持介質(zhì)電泳常用的支持介質(zhì)可分為兩大類：1、大孔材料：主要起支持作用，并可阻止對(duì)流，減少擴(kuò)散。如濾紙、醋酸纖維素薄膜、硝酸纖維素薄膜等，蛋白質(zhì)等物質(zhì)在這些材料上電泳分離時(shí)主要取決于物質(zhì)的帶電量，帶電量少的移動(dòng)慢，帶電量多的移動(dòng)快。2、凝膠材料：除起支持作用和阻止對(duì)流，減少擴(kuò)散外，還兼有分子篩作用。如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠等，蛋白質(zhì)等物質(zhì)電泳分離時(shí)既與物質(zhì)的帶電性