例子1：丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)研究

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1、微生物過量合成丙酮酸及代謝網(wǎng)絡分析1研究背景為什么要研究發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸?本研究的立題意義何在?關于丙酮酸的生物合成，國外的研究進展如何?2丙酮酸是糖代謝中最重要的中間產(chǎn)物。它位于合成代謝與分解代謝的轉(zhuǎn)折點，在生物能量代謝中具有十分重要的作用。在化工、制藥和農(nóng)用化學品等工業(yè)及科學研究中有著廣泛的用途。?為什么要對發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸進行研究?3丙酮酸的主要用途4?丙酮酸的化學法生產(chǎn)工藝酒石酸脫水脫羧法目前用的主要生產(chǎn)方法：將酒石酸與硫酸氫鉀混合物在220℃下蒸餾，餾出物再經(jīng)真空精餾即可得到丙酮酸。其主要缺點是

2、∶(1)丙酮酸產(chǎn)率較低(對酒石酸質(zhì)量產(chǎn)率為0.29～0.30g/g)；(2)得到1g丙酮酸需要消耗5g硫酸氫鉀以目前酒石酸(1.5萬元/t)和硫酸氫鉀(0.6萬元/t)的市場價格計算，僅原料成本就至少需要8萬元/t導致丙酮酸的價格居高不下。5?丙酮酸的發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸在成本上具有明顯優(yōu)勢。問題是丙酮酸高產(chǎn)菌株的選育非常困難。日本已經(jīng)實現(xiàn)了發(fā)酵法丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)，但在我國，尚未見到任何專利或研究報告。6酵母直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸?國外研究水平細菌或放線菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸休止細胞法生產(chǎn)丙酮酸完整細胞

3、(或酶法)生產(chǎn)丙酮酸7酵母直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸Ⅰ∶丙酮酸脫羧酶(PDC)Ⅱ∶轉(zhuǎn)氨酶(PT)Ⅲ∶丙酮酸羧化酶(PC)Ⅳ∶丙酮酸脫氫酶系(PDH)煙酸(NA)維生素B1(B1)維生素B6(B6)生物素(Bio)8酵母直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸(表1)9酵母直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸(表2)10細菌或放線菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸11休止細胞法生產(chǎn)丙酮酸12完整細胞或酶法生產(chǎn)丙酮酸13?以獲得丙酮酸高產(chǎn)率、高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強度的相對統(tǒng)一為目標。?盡量減少丙酮酸的降解或轉(zhuǎn)化。?本研究的學術思想是什么??盡量加快由葡萄糖到丙酮酸

4、的代謝速度。14?國外同類研究有哪些問題?具有多種遺傳標記的Torulopsisglabrata在搖瓶培養(yǎng)中丙酮酸產(chǎn)量和產(chǎn)率已分別達到56.8g/L和0.58g/g(日本)在3L發(fā)酵罐流加培養(yǎng)中，丙酮酸產(chǎn)量可達67.8/L，其代價是丙酮酸產(chǎn)率(Yp/s)僅為0.49g/g15找出對發(fā)酵過程最重要的影響因素。?對一種產(chǎn)品，怎樣獲得高產(chǎn)率、高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強度的相對統(tǒng)一?提出相應的控制方法或策略。對這些因素的影響規(guī)律進行生理學分析。16?T.glabrata生產(chǎn)丙酮酸存在的問題(1)均以蛋白胨為氮源，產(chǎn)率最高僅為

5、0.58g/g。(2)所缺陷的維生素在丙酮酸過量合成中的調(diào)控作用及影響次序如何?(3)發(fā)酵過程中，溶氧控制在什么水平好，應當怎樣控制?(4)怎樣全面提高丙酮酸的發(fā)酵水平?17本研究目標學術目標∶透徹分析球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的生理學本質(zhì)，采用一系列控制策略實現(xiàn)丙酮酸的過量合成。應用目標∶確定可放大的發(fā)酵工藝，完成300L規(guī)模的發(fā)酵試驗，為實現(xiàn)工業(yè)化奠定基礎。18本課題的主要研究內(nèi)容1.營養(yǎng)條件對光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的影響2.維生素在丙酮酸過量合成中的重要作用3.丙酮酸分批發(fā)酵的供氧控制模式5.光滑球擬酵

6、母過量合成丙酮酸的代謝特征4.丙酮酸發(fā)酵過程的代謝網(wǎng)絡分析191.營養(yǎng)條件對光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的影響(1)維生素在丙酮酸過量合成中的重要作用(2)丙酮酸分批發(fā)酵的供氧控制模式(4)光滑球擬酵母過量合成丙酮酸的代謝特征(3)丙酮酸發(fā)酵過程的代謝網(wǎng)絡分析光滑球擬酵母WSH-IP12是一株多重維生素營養(yǎng)缺陷型確定較佳的營養(yǎng)條件是優(yōu)化發(fā)酵過程的基礎性工作研究思路20本部分主要研究內(nèi)容氮源種類(酵母粉、蛋白胨、豆餅水解液、無機氮源)及其濃度的影響供氧方式和碳氮比的影響流加培養(yǎng)中氮有效供給的重要性21?氮源種類及

7、其濃度的影響酵母粉添加量的影響(g/L):○zero；□1；△3；●5；■8；▲1022蛋白胨添加量的影響●丙酮酸；□乙醇；○細胞干重；■葡萄糖23豆餅水解液添加量的影響□丙酮酸；○細胞干重24無機氮源的影響25氮源種類及其濃度的影響∶小結1)酵母粉質(zhì)量濃度大于1g/L將導致丙酮酸產(chǎn)量大幅度減少。2)雖然該菌株能夠利用豆餅水解液和無機氮源，但結果不如蛋白胨理想。26供氧方式的影響○and…0-39h,700rpm；△and─0-6h，400rpm;6-14h,500rpm;14-37h,600rpm供氧方式和

8、碳氮比的影響27不同供氧方式控制的發(fā)酵過程參數(shù)比較28培養(yǎng)基碳氮比的影響●glucose92g/L,peptone15g/L■glucose127g/L,peptone20g/L○glucose201g/L,peptone20g/L29培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度和/或碳氮比的影響30供氧方式及碳氮比的影響∶小結1)較高的溶氧水平下，細胞生長和葡萄糖消耗速度相對較慢，但丙酮酸產(chǎn)量(39.0g/L)和產(chǎn)率(