基因組與比較基因組學(xué)

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1、11基因組與比較基因組學(xué)11.1高通量DNA序列分析技術(shù)11.2人類基因組計(jì)劃11.3其他基因組11.4比較基因組學(xué)及相關(guān)研究20世紀(jì)人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉：1940年代第一顆原子彈爆炸；1960年代人類首次登上月球；1990年代提出并已基本完成的人類基因組計(jì)劃（HGP）?；蚪M學(xué)是美國(guó)人T·H·Rodehck在1986年7月提出來(lái)的。基因組是生物體內(nèi)遺傳信息的集合，是某個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子的總和。原核生物基因組：原核生物DNA分布在整個(gè)細(xì)胞之中，有時(shí)相對(duì)集中在類核體上。類核體上的DNA是一條共價(jià)、閉合雙鏈分子，類核體通常也稱為染色體。這條染色體的DNA就

2、是原核細(xì)胞的基因組。真核生物基因組：一個(gè)物種的單倍體的各條染色體中的全部DNA為該物種的基因組（genome）。例如，人有23對(duì)染色體，配子——單倍體是23條染色體，這23條染色體中的全部DNA就是人體基因組。11.1高通量DNA序列分析技術(shù)1.DNA序列測(cè)定的基本原理DNA自動(dòng)測(cè)序儀可快速測(cè)定DNA序列，計(jì)算機(jī)處理能力的快速提高則使得大量DNA小片段很容易拼接成較大的片段甚至整個(gè)染色體。高效快捷的DNA測(cè)序方法是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的，主要有兩種：Sanger的雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert的化學(xué)修飾法。Sanger的雙脫氧鏈終止法基本原理：核酸模

3、板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳，以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段（長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基），根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法：1）基本原理：用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈

4、降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。2）基本步驟：（1）同位素標(biāo)記DNA片段的5’端；（2）在特殊位置上通過(guò)化學(xué)反應(yīng)隨機(jī)打斷DNA鏈G,A(someG),T(someC)，C；（3）形成大小不一的DNA鏈；（4）電泳分離DNA鏈；（5）根據(jù)同位素標(biāo)記自顯影后讀出序列。3）優(yōu)點(diǎn)：不存在因DNA序列或結(jié)構(gòu)引起DNA合成問(wèn)題，能測(cè)定用酶學(xué)方法不能正常測(cè)序的DNA序列。4）缺點(diǎn)：需使用劇毒化學(xué)試劑。DNA測(cè)序自動(dòng)化：1）使用熒光標(biāo)記的dNTP；2）毛細(xì)管電泳；3）激光檢測(cè)讀序。PCR用于制備測(cè)序反應(yīng)：1）測(cè)序反應(yīng)實(shí)質(zhì)就是DNA擴(kuò)增，因而

5、可以用PCR進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。2）與典型PCR反應(yīng)的不同：（1）只用一個(gè)引物；（2）需用測(cè)序級(jí)的DNA聚合酶；（3）DNA模板量高，一般0.5-1.0mg；（3）循環(huán)次數(shù)多，一般35-40個(gè)循環(huán)；（4）產(chǎn)物需純化干燥。實(shí)際工作中如要進(jìn)行DNA測(cè)序，需要準(zhǔn)備什么？1）克隆你的目的基因或其片段；2）鑒定你所得到的含目的基因或片段的重組質(zhì)粒；3）將含重組質(zhì)粒的細(xì)菌或質(zhì)粒送測(cè)序公司；4）等結(jié)果。2.基因組DNA大片段文庫(kù)的構(gòu)建構(gòu)建基因文庫(kù)是測(cè)序前必須的預(yù)備工作。酵母人工染色體技術(shù)（YAC）為創(chuàng)制基因組物理圖提供了極大的方便。ARS序列（Ori），CEN序列，TEL序列。YAC的主

6、要缺點(diǎn)：1）存在高比例的嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來(lái)不相連的獨(dú)立片段；2）部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排；3）難與酵母染色體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閅AC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)。4）操作時(shí)容易發(fā)生染色體機(jī)械切割。用細(xì)菌的F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建了細(xì)菌染色體克隆載體BAC，其克隆能力在125-150kb左右。質(zhì)粒主要包括oriS，repE（控制F質(zhì)粒復(fù)制）和parA、parB（控制拷貝數(shù)）等成分。以BAC為基礎(chǔ)的克隆載體轉(zhuǎn)化效率高，而且以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌體內(nèi)，易于分辨和分離純化。3.鳥(niǎo)槍法基因組序列分析技術(shù)DNA序列分析技術(shù)一次測(cè)序反應(yīng)的長(zhǎng)度不能超過(guò)1

7、kb，不能直接用BAC等大片段作為序列分析的模板，采用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序技術(shù)——隨機(jī)挑選插入基因組DNA的質(zhì)粒做測(cè)序反應(yīng)，然后用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列拼接。采用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序的基本原理：對(duì)某基因組文庫(kù)全部克隆片段進(jìn)行末端序列測(cè)定中未測(cè)到的堿基數(shù)，即缺口(gap)，與已測(cè)定的總堿基數(shù)相關(guān)。隨著已測(cè)定堿基數(shù)的增加，缺口的總堿基數(shù)目會(huì)按照泊松公式的一個(gè)推論（P=e-m）迅速減小。其中P為基因組中某個(gè)堿基未被測(cè)定的概率，m為所測(cè)定的堿基數(shù)與基因組大小相比的倍數(shù)。m越大P值越小。當(dāng)m=5（即隨機(jī)測(cè)定的堿基數(shù)達(dá)到基因組5倍），基因組中未測(cè)定的堿基數(shù)為