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《分子克隆載體的選擇》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、第八節(jié)分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)1）實驗對象2）實驗性質(zhì)3）載體容量4）合適克隆位點5）載體的穩(wěn)定性6）載體DNA制備的難易7）外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等2.實驗對象1）供體：遺傳背景與DNA特點等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統(tǒng)，DNA重組基因特點，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同
2、載體要求不同菌株。如：E.coliDH5:F–,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96E.coliDH5α:F–,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96;φ80dlacZ△M15,△(lacZYA-argF)U169E.coliDH5αF’:F’,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96,φ80dlacZ△M15,△(lacZYA-ar
3、gF)U169i.三者均有限制-修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發(fā)生重組ii.DH5α和DH5αF’都具有一個可供遺傳標(biāo)記lacZα檢測的遺傳背景iii.DH5αF’可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在3.實驗性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步：i.分離供體DNA或RNA（mRNA）和載體DNAⅱ.構(gòu)建基因文庫或cDNA文庫ⅲ.目的基因或cDNA克隆的篩選ⅳ.目的基因或cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等ⅴ.基因表達與調(diào)控機理的研究1)建立文庫用載體常在E.coli進行i.目
4、的基因與供體基因大小小—質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡單大—λ或cos質(zhì)粒載體,甚至P1或pYAC載體(為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用λ和cos載體）ii.篩選方法ⅰ)互補法：可表達,選一般載體;不表達，選表達載體(外源基因必須表達，表達產(chǎn)物必須具備活性)ⅱ)免疫法：與上同，但表達產(chǎn)物不一定具生物活性ⅲ)雜交法：各種載體均可2)目的基因的鑒定次克?。哼x用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等定序：定序載體（M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6啟動子載體）3)基因表達與調(diào)控外源基因可表達—普通載體;不表達
5、—表達型（分泌）載體4.載體容量M13mp載體<4kb細菌質(zhì)粒載體<10kbλ載體<23kbcos質(zhì)粒載體<48kbP1載體<95kbpYAC載體∽1000kb5.合適的克隆位點單克隆位點和多克隆位點第九節(jié)分子克隆載體的組建構(gòu)建克隆載體必須考慮的條件：復(fù)制起點，克隆位點，標(biāo)記基因，載體容量等。1.克隆位點的建立1)體外重組i.減少限制酶識別位點ii.增加限制酶識別位點：人工接頭，匹配接頭2)體內(nèi)重組或突變i.減少限制酶識別位點體內(nèi)自發(fā)突變和體外限制酶切富集。如在構(gòu)建pSUPV系列載體時，去除Kanr基因中的HindIII位點就采用了以下技術(shù)路線：
6、培養(yǎng)有pNG35的大腸桿菌細胞提取質(zhì)粒DNA用HindIII完全酶切轉(zhuǎn)化大腸桿菌再提取質(zhì)粒DNA再酶切，再轉(zhuǎn)化，直至提取單菌落質(zhì)粒DNA已無法用HindIII酶切為止ii.增加限制酶識別位點M13mp系列載體構(gòu)建中EcoRI位點的建立體外誘變體內(nèi)錯配體外篩選α-肽鏈ThrMetIleThrAspSerM13mp正鏈5'…ATGACCATGATTACGGATTCACT…3'CH3互補鏈負鏈3'…TACTGGTACTAATGCTTAAGTGA…5'M13mp正鏈5'…ATGACCATGATTACGAATTCACT…3'α’-肽鏈ThrMetIleTh
7、rAsnSer2.標(biāo)記基因的建立1）啟動子2）編碼區(qū)—密碼子偏愛性，基因產(chǎn)物適用范圍3）終止子3.載體容量盡可能除去無關(guān)的DNA序列。第二章練習(xí)題1．當(dāng)一DNA片段插入終止子探針型載體pBU10的HindⅢ克隆位點后，重組質(zhì)粒仍可轉(zhuǎn)化E.coli(CmlsTcs)為CmlrTcr，為什么?可設(shè)計什么實驗證明其假設(shè)?2．當(dāng)一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出現(xiàn)兩類菌落，蘭色菌落和白色菌落。從白色菌落中分離純化的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢查，均比原載體DNA分子大；但從蘭色菌落隨機分離的質(zhì)粒DNA卻有兩類，其中一類與載體大小相同，另一類卻與白色菌落中
8、分離的質(zhì)粒大小相同。如何解釋這一實驗結(jié)果?可設(shè)計何種實驗證明你的解釋是正確的?3．當(dāng)把一外源DNA插入一克隆載體后，重組DNA分子轉(zhuǎn)化E
