分子克隆載體

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1、分子克隆載體周俊宜fzyxzjy@126.com基因工程的表達(dá)體系操縱子理論在基因工程中的應(yīng)用目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性常用基因載體基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒基因工程的表達(dá)體系原核生物表達(dá)體系：大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：積累了充足經(jīng)驗(yàn)，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因

2、先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞上表達(dá)。缺點(diǎn)：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進(jìn)入動物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；常會形成包涵體。表達(dá)體系的發(fā)展表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體基因工程的目的是使目的基因能高效表達(dá)。基因表達(dá)受DNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)因子與核酸相互辨認(rèn)、結(jié)合等組成的表達(dá)體系的調(diào)

3、控。基因表達(dá)調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進(jìn)行基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造。操縱子理論在基因工程的應(yīng)用一、啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原核生物的轉(zhuǎn)錄單位是操縱子，操縱子包括相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列操縱子P：啟動序列O：操縱序列I：調(diào)節(jié)序列IPOCAP調(diào)控區(qū)ZYX結(jié)構(gòu)基因以乳糖操縱子（lacoperon）為例：誘導(dǎo)物ZYXIPOCAPZYXIPOCAP二、強(qiáng)啟動子的構(gòu)建開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowb

4、ox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205?3?3?5?原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5?5?RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3?3?RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列TAT

5、A盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動子保守序列RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合Ptac啟動子Ptrp與Plac的雜化產(chǎn)物Ptac比原來各自的活性強(qiáng)-35區(qū)-10區(qū)PtrpTTGACATTAACT共有序列TTGACATATAATPtac17TTGACATATAAT乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。LacZ基因編碼的乳糖苷酶X-gal藍(lán)色吲

6、哚產(chǎn)物三、藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal試驗(yàn)）誘導(dǎo)物ZYXPOZYXPO乳糖標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H?片段COOH?片段lacZX-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶轉(zhuǎn)錄終止：非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止需要莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以t（termination）代表。CGGCCGCGGCCUAAUGA5’…AUACCAUUUUUUUUU…3’四、轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)的插入莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)

7、合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG5?3?3?5?RNA-pol五、增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄起始前-30區(qū)為TATA盒，還有多種順式作用組件相互配搭成啟動子。增強(qiáng)子遠(yuǎn)距離地、不同方向地控制啟動子的活性。增強(qiáng)子的核心序列是TGTGGAATTAG。增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)有：非特異性遠(yuǎn)距離操縱、多方向性。酵母結(jié)構(gòu)基因的上游還有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性核糖體結(jié)合位點(diǎn)（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA結(jié)合的位點(diǎn)S-D序列(Shine-Dalgar

8、no)，又稱為核糖體結(jié)合點(diǎn)。3’…ACACUAGG…5’16sRNAUCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7個Pu是核糖體小亞基的辨認(rèn)部位lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP基因克隆時的定向插入插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正