大腸桿菌分子克隆載體.ppt

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1、第三節(jié)大腸桿菌分子克隆載體一、E.coli克隆載體的種類1.質(zhì)粒載體—復(fù)制起點(diǎn)來自一些天然質(zhì)粒。2.噬菌體載體—λ，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。3.COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝4.噬粒載體（phagemid）—有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。二、質(zhì)粒與質(zhì)粒載體1.E．coli的質(zhì)粒種類1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。2)R因子（抗藥性因子）可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝嚴(yán)緊型，質(zhì)粒較大，操作不便3)F因子（性因子）2.質(zhì)粒的特點(diǎn)1)質(zhì)粒D

2、NA復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)2)質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在3)質(zhì)粒DNA可以接合轉(zhuǎn)移4)質(zhì)粒的不相容性和不相容群5)質(zhì)粒DNA的消除—化學(xué)和物理法(吖啶染料，EtBr，高溫等)6)質(zhì)粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色體中3.質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移1）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移過程質(zhì)粒的自主轉(zhuǎn)移過程質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移和復(fù)制2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的必備條件ⅰ.轉(zhuǎn)移起點(diǎn)(oriT),它是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)—順式作用（cis-action）ii.細(xì)胞附屬物—性纖毛，由蛋白質(zhì)構(gòu)成—反式作用ⅲ.轉(zhuǎn)移過程所需的全部酶類—反式作用3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型ⅰ.自我轉(zhuǎn)移（Self-transmi

3、ssible）ⅱ.輔助轉(zhuǎn)移（Donation）—可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒僅具備oriT，若無輔助質(zhì)粒，前者不會(huì)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。若輔助質(zhì)粒可提供所有反式作用的蛋白質(zhì)，前者便會(huì)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。ⅲ.重組轉(zhuǎn)移（conduction）—若質(zhì)粒無oriT，該質(zhì)粒只有整合到輔助質(zhì)粒DNA中，重組質(zhì)粒便可轉(zhuǎn)移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆載體，只要具備oriT即可，另外兩類功能基因可置于輔助質(zhì)粒上，該質(zhì)粒一般沒有oriT，因而可以減少后者進(jìn)入另一種細(xì)胞的頻率。質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)移R-重組DNA分子4.質(zhì)粒DNA的復(fù)制和調(diào)節(jié)控制1)復(fù)制機(jī)制—復(fù)制方向、終止和方式

4、2)質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制—抑制劑模型：高拷貝質(zhì)粒需高濃度抑制劑，低拷貝質(zhì)粒需低濃度抑制劑，同一不相容群質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制劑可交叉相互作用。3)質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制例子:ColE1質(zhì)粒的復(fù)制及復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)Borosetal.(1984)分離到一個(gè)pBR322突變體，其拷貝數(shù)可達(dá)1000/cell或65%總DNA，原因是在RNAI基因的3'端附近發(fā)生一次G→T顛換。ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA的復(fù)制過程5.大腸桿菌質(zhì)粒載體1)常用質(zhì)粒載體的復(fù)制子質(zhì)粒載體復(fù)制子來源拷貝數(shù)pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A1

5、0-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-202)質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZα3)多克隆位點(diǎn)區(qū)大多數(shù)從pUC系列中的多克隆位點(diǎn)衍生出來的6.實(shí)例—pUC18和pUC19pUC系列質(zhì)粒載體由Messingetal.構(gòu)建，具有三個(gè)顯著特點(diǎn)：1）分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大2）易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα3）多克隆位點(diǎn)區(qū)ⅰ.多克隆位點(diǎn)成對(duì)地存在于pUC18和pUC19中，位點(diǎn)排列順序相同，但方向相反。這種排列方式有利于外源DNA的克隆和定向

6、插入ⅱ.產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列:兩端限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），與之相鄰的兩個(gè)限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四個(gè)限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’—突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。pUC18和pUC19載體如插入片段的5’段定向缺失:XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase;插入片段的3’-端亦可采用類似的方法進(jìn)行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase）不同載體中的多克隆位點(diǎn)區(qū)可以供不同目的片段的重組。又例如

7、:pBS+多克隆位點(diǎn)區(qū)的排列順序是(見圖)：假設(shè)有一EcoRI→HindⅢDNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外的DNA片段（如終止子、啟動(dòng)子），顯然，pUC系列載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點(diǎn)區(qū)就能滿足要求。ⅲ.多克隆位點(diǎn)集中排列，有利于克隆片段的物理圖譜的繪制。除上述三個(gè)特點(diǎn)外，pUC系列載體還可用于表達(dá)外源基因（LacZα啟動(dòng)子）。pBS載體的結(jié)構(gòu)三.噬菌體載體1.噬菌體λ載體1）λ的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)i.一般結(jié)構(gòu)：48,502bp，線狀ds-DNA，兩端具有12n.t5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’

8、）該末端稱為cos位點(diǎn)，可被λ編碼的末端酶所識(shí)別（該酶由λ末端的兩個(gè)基因Nul和A編碼蛋白gp