實(shí)驗(yàn)八：DNA的顯示--Feulgen反應(yīng)

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1、實(shí)驗(yàn)八：DNA的顯示——Feulgen反應(yīng)【課前預(yù)習(xí)】1．Feulgen反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理和關(guān)鍵步驟是什么？2．在稀鹽酸水解后，為什么要用亞硫酸水進(jìn)行洗片？【目的要求】1．熟悉并掌握Feulgen反應(yīng)的原理及其實(shí)驗(yàn)操作方法2．對細(xì)胞的免疫組化研究方法有初步的認(rèn)識【基本原理】Feulgen反應(yīng)（Feulgenreaction）是顯示DNA的最典型的組織化學(xué)反應(yīng)，為學(xué)者Feulgen和Rossenbeck于1924年發(fā)明，簡稱為Feulgen法。因?qū)NA的顯示反應(yīng)具有高度專一性，故常被用來顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的分布情況。自Feulgen等發(fā)明該顯示DNA的Feulgen反應(yīng)法以來，其作用

2、機(jī)制也久經(jīng)研究和討論，現(xiàn)已取得一致意見。其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子,因醌基為發(fā)色團(tuán)，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說,DNA經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。其反應(yīng)機(jī)制如下圖所示。2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3DNA經(jīng)溫稀酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核酸之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑中的無色品紅反應(yīng)，形成紫紅色的化合物

3、，因此Feulgen反應(yīng)中，顯示紫紅色的細(xì)胞部位，即標(biāo)志有DNA的存在。Feulgen反應(yīng)現(xiàn)仍廣泛用于DNA的定性定位和定量的顯微測定技術(shù)上?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材顯微鏡、立式染色缸、水浴鍋2．材料香柏油，擦鏡紙，蓋玻片，載玻片3．試劑1）schiff氏試劑將0.5g堿性品紅置入三角燒瓶內(nèi)沸騰的蒸餾水中，時時搖動玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷卻至50℃時過濾，加入10ml1mol/LHCl，冷至25℃時，加入0.5g偏重亞硫酸鈉（Na2S2O3）無水亞硫酸鈉（NaHSO3），在室溫冷暗處至少放置24h（有時需2~3天），使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，最好保存于4℃

4、冰箱中（可保存數(shù)月或更長時間）。在使用前加入0.5g活性碳,搖1min,用粗濾紙過濾，濾液應(yīng)為無色；若液體顏色變?yōu)榉奂t色，便不能再用。2）亞硫酸水（洗滌劑）：用200ml普通自來水（不要用蒸餾水,以免引起誤差）、10ml10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml1mol/LHCl，三者在使用前混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。3）1mol/LHCl（水解用）：取82.5ml比重為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成（應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中）?！痉椒ú襟E】【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】細(xì)胞核中的DNA呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來判斷DNA的相對含量。細(xì)胞質(zhì)被亮

5、綠復(fù)染成綠色，核仁通常為負(fù)反應(yīng)；但在有些材料的細(xì)胞質(zhì)中，DNA也會出現(xiàn)陽性反應(yīng)。小鼠肝切片F(xiàn)eulgen染色大蒜根尖Feulgen染色【實(shí)驗(yàn)報告】1．繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果。2．總結(jié)Feulgen反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素。