常用實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)

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1、常用實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)（續(xù)）山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室史瑋四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Westernblot）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture）是指從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外適當(dāng)?shù)臈l件下，使之存活、生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)便于應(yīng)用各種方法和技術(shù)進(jìn)行研究，并可直接觀察，已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件無(wú)菌環(huán)境（器皿、超凈臺(tái)）超純水溫度（37℃左右）氣體（5%CO2

2、/空氣）PH值（7.0-7.4，細(xì)胞耐酸不耐堿）營(yíng)養(yǎng)條件（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS）滲透壓、培養(yǎng)基質(zhì)等細(xì)胞培養(yǎng)用液平衡鹽溶液：洗滌組織、細(xì)胞D-Hanks液、PBS液等。消化液：分散細(xì)胞0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用培養(yǎng)液：細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和繁殖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640等），已商品化10%左右的胎牛血清（FBS）培養(yǎng)細(xì)胞的來(lái)源直接取材：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、胚胎、臨床標(biāo)本等細(xì)胞系：各實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞庫(kù)：上海中科院細(xì)胞庫(kù)、武漢細(xì)胞庫(kù)、中國(guó)醫(yī)科院細(xì)胞中心培養(yǎng)方式原代培養(yǎng)：直接從生物體內(nèi)獲取組織細(xì)胞進(jìn)

3、行的首次培養(yǎng)。只能原代培養(yǎng)：神經(jīng)元、心肌細(xì)胞等。傳代培養(yǎng)：當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞增殖到一定密度后，生長(zhǎng)受到抑制，需要分散稀釋后重新培養(yǎng)。常見：腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)細(xì)胞的處理改變細(xì)胞外部因素改變細(xì)胞內(nèi)部因素外部因素藥物高溫低氧射線…內(nèi)部因素改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平：上調(diào)：基因轉(zhuǎn)染下調(diào)：RNAi細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（transfection）是指將外源性DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。上調(diào)目的基因表達(dá)：質(zhì)粒載體病毒載體下調(diào)目的基因表達(dá)：化學(xué)合成siRNA質(zhì)粒載體病毒載體轉(zhuǎn)染方法電轉(zhuǎn)法脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法…轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體與非脂質(zhì)體

4、：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。常用：Invitrogen公司Lipofectamine2000可用來(lái)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA.其他專用試劑：如Invitrogen公司RNAiMAXTransfectionReagent專門用來(lái)轉(zhuǎn)染siRNA.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：將DNA導(dǎo)入活細(xì)胞內(nèi)，但DNA不會(huì)嵌入細(xì)胞的染色體中，可在2-3天內(nèi)收集被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：將目的基因?qū)牖罴?xì)胞，根據(jù)選擇標(biāo)記經(jīng)過一段時(shí)間的篩選，使目的基因整合入細(xì)胞染色體中，從

5、而得到穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系。真核篩選標(biāo)記設(shè)立對(duì)照組空載體對(duì)照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。ScrambledsiRNA：將選中的siRNA序列打亂。作為陰性對(duì)照的scrambledsiRNA應(yīng)該與選中的siRNA序列有相同的核苷酸組成，并且與目的基因的mRNA沒有明顯的同源性。細(xì)胞特性檢測(cè)活力：MTT實(shí)驗(yàn)凋亡：TUNEL染色、流式細(xì)胞術(shù)等增殖：BrdU摻入法、克隆形成實(shí)驗(yàn)分化：形態(tài)學(xué)觀察、分化標(biāo)志物檢測(cè)致瘤性：體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)…靶基因表達(dá)水平檢測(cè)RT-PCRWesternblot免疫組化其他：基因芯片、流

6、式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用用途：1.驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.進(jìn)行深入機(jī)制研究?jī)?yōu)點(diǎn)：可同時(shí)獲得大量生物學(xué)性質(zhì)相似的細(xì)胞作為研究對(duì)象，便于施加各種干預(yù)因素，方便觀察與檢測(cè)。局限性：不能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)的真實(shí)狀況，需與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相互驗(yàn)證。神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)取E12.5d小鼠胚胎端腦，制成單細(xì)胞懸液，接種于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)2天，可見神經(jīng)球形成。NSC鑒定體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞BrdU(+)，Nestin(+)，并能分化為MAP2(+)神經(jīng)元和GFAP(+)星形膠質(zhì)細(xì)胞。出生后7天小鼠腦切片，可見G-CSFR與Nestin共表達(dá)

7、。SVZ：室管膜下區(qū)；LV：側(cè)腦室體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，免疫染色結(jié)果顯示：Nestin（神經(jīng)干細(xì)胞marker）與G-CSFR共表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果也顯示神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)G-CSFR。體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，免疫染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，G-CSF作用組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高。小鼠腦切片，免疫染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組（CT）及缺血缺氧性模型組（HI）相比，G-CSF處理組（HI+G-CSF）室管膜下區(qū)（SVZ）BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。謝謝！