細胞培養(yǎng)基本技術

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1、細胞培養(yǎng)基本技術細胞培養(yǎng)的甚本概念傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)：使用單個細胞懸液組織培養(yǎng)：使用組織塊（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個器宮原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期有限細胞系，無限細胞系細胞系cellline細胞株cellstrain培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種

2、造血系統腫瘤細胞每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數生長期：細胞

3、數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒實驗準備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿

4、消毒濾器：過濾除菌：大多數培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。濾器CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中

5、以保持箱內濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動雙重純水蒸餾器純水儀酶標儀微孔板震蕩器培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干清潔液的配制2細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種

6、黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-164

7、0、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于