細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

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1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的甚本概念傳代:細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后,被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中.原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng).細(xì)胞培養(yǎng):使用單個細(xì)胞懸液組織培養(yǎng):使用組織塊(O.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)器官培養(yǎng):使用器官原基或器官的一部分或整個器宮原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期有限細(xì)胞系,無限細(xì)胞系細(xì)胞系cellline細(xì)胞株cellstrain培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼附生長:必須貼附于支持物表面才能生長.見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮生長:于懸浮狀態(tài)下即可生長,不需要貼

2、附于支持物表面.見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期(平臺期)游離期:細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài).也稱懸浮期.此時細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形.10分鐘一4小時貼壁期:細(xì)胞附著于底物上,游離期結(jié)束.細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁.底物:膠原,玻璃,塑料,其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素,膠原等糖蛋白(生長基質(zhì)),這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上,懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著.進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)(化學(xué)合成的功能基團(tuán))潛伏期此時細(xì)胞有生長話動,而無細(xì)胞分裂.

3、細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時.對數(shù)生長期:細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長,活力最佳,最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究.停止期(平臺期):細(xì)胞長滿瓶壁后,細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制:接觸抑制,密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1細(xì)胞的營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品:超凈工作臺,壓力蒸汽消毒器,電熱干燥箱,濾器,酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀,微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器,純水儀耗材:培養(yǎng)瓶,吸管,電動吸引器,培養(yǎng)板,凍存管壓力蒸汽消毒器:濕

4、熱消毒,用途廣電熱干燥箱:干熱消毒(160℃,2小時).主要用干玻璃器皿消毒濾器:過濾除菌:大多數(shù)培養(yǎng)用液,如人工合成培養(yǎng)基,血清,酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺:為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈:紫外線消毒.主要用于培養(yǎng)室空氣,操作臺,塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒,使空氣得到凈化.凈化空氣徐徐通過工作臺面,使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境.濾器CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃,5%CO2.使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題:①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時,需將瓶蓋微松,以保證

5、通氣.②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈.定期消毒(90℃,14h).③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度,避兔培養(yǎng)液蒸發(fā).自動雙重純水蒸餾器純水儀酶標(biāo)儀微孔板震蕩器培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶常用玻璃器皿清洗浸泡(自來水),刷洗(洗衣粉),酸泡(24小時),流水沖洗,蒸溜水浸泡和沖洗,50℃烘干清潔液的配制2細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水:新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液:無Ca2+,Mg2+的緩沖液PBS:NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液:胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健,除去細(xì)

6、胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細(xì)胞骨架,從而使細(xì)胞分離.胰蛋白酶液濃度越高,作用越強(qiáng),但超過一定限度會損傷細(xì)胞.胰蛋白酶是一種黃白色粉末,用無Ca2+,Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%.用濾器過濾除菌.胰蛋白酶液消化時間:2-10分鐘.用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液,分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基.天然培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基有血清,血漿,和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液).優(yōu)點(diǎn):營養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好缺點(diǎn):來源受限.成分復(fù)雜,影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析.易發(fā)生支原體污

7、染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用人工方法模擬合成的.目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基,如TC199,MEM,RPMI-1640,DMEM等.合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸,維生素,碳水化合物,無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì).優(yōu)點(diǎn):標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),組分和含量相對固定.成本低缺點(diǎn):缺少某些成分,不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要.人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存,要想使細(xì)胞生長和繁殖,還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清).血清中含有:①多種蛋白質(zhì)(白蛋白,球蛋白,鐵蛋白等)②多種金屬離子;③激素;④促貼附物質(zhì),如纖粘蛋白,冷析球蛋白,膠原等.⑤各種生長因

8、子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分一般說來.含5%小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死.但支持細(xì)胞生長一般需加10%血清.對于