畢赤酵母的基因表達及其初步純化

《畢赤酵母的基因表達及其初步純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。

1、4Aβ15基因在畢赤氏酵母中的分泌表達及初步純化——Alade畢赤氏酵母作為表達載體的優(yōu)點1、表達效率高，遺傳穩(wěn)定性好2、結構簡單，表達調控機理比較清楚3、有Pr加工系統4、培養(yǎng)簡單，成本低廉5、表達產物可分泌至培養(yǎng)基中而自身蛋白的分泌卻很少，利于下游的純化（畢赤氏酵母是近年來廣泛應用的真核表達系統。）一、實驗材料DH5α、pPICZαA、GS115、TOP10、，pQE4Aβ15pMD18T載體、Pfu高保真酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶.PCR產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP、增強型

2、HRP-DAB、底物顯色試劑盒.基因在畢赤氏酵母中表達的簡單過程4Aβ15基因的獲取(PCR)↓目的基因的修飾與克隆↓表達載體的構建↓畢赤氏酵母的線性化、電轉化與鑒定↓目的基因在畢赤酵母GS115中的表達↓重組蛋白的鑒定與分析↓重組4A15的初步純化1、目的基因4Aβ15獲取----PCR在設計N端引物時引入XhoⅠ酶切位點及Kex2信號肽水解位點，并刪除Kex2后面的Ste3位點（Glu-Ala-Glu-Ala）在下游引物（5GCTCTAGATTGATGATGAACTTCATA3）引入終止密碼子和XbaⅠ酶切位

3、點，目的基因4Aβ15獲取----PCR以pQE4Aβ15為模板，進行PCR擴增，擴增條件為94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存.1.5%瓊脂糖分析PCR產物2、目的基因的修飾與克隆PCR擴增產物回收后+克隆載體pMD18T以1：3（V）的比例通過T4連接酶接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α，菌落PCR。分析陽性菌落：挑取4個陽性菌落進行序列分析.序列正確的命名為p4Aβ153、表達載體的構建雙酶切基因片段p4Aβ15，用試劑盒回收，雙酶切質質粒pPI

4、CZaA，回收大片段，定向連接，連接產物在低鹽的LB平板上培養(yǎng)。挑取抗性菌落提取質粒，進行雙酶切鑒定。5、畢赤氏酵母GS115的電轉化與鑒定——5.1電轉化1、線性化——限制性內切酶BstXI單酶切表達載體和重組質粒2、電轉化——電激轉化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細胞（轉化條件：電壓1500V，4ms）.電轉化完成后培養(yǎng)轉化物涂布于Zeocin100mg/L的YPD平板上，28℃恒溫培養(yǎng)36h左右，抗性平板上生長的菌落相應的命名GS115/pPICZaA和GS115/pPICZa4Aβ15.5、畢赤氏酵母GS115

5、的電轉化與鑒定——5.2轉化子的鑒定提取抗性菌落的基因組DNA,(方法參見Invitrogen酵母手冊).以此基因組DNA為模板，pPICZaA5Aox1primer和3Aox1primer為引物進行PCR.1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析6、目的基因在畢赤酵母GS115中表達挑陽性克隆單菌落接種于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素……）的培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)（28℃，250r/min培養(yǎng)至OD600為2~6）離心收集菌體，用BMMY重懸，至OD600≈1繼續(xù)搖床。.每24h向培養(yǎng)基中添加無水甲醇（誘導表達產物分泌到培養(yǎng)基

6、中）至終濃度為1%；每24h取樣，離心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后進行12%SDS-PAGE分析.對GS115和GS115/pPICZaA作同樣的處理，以便于下游SDSPAGE的分析6、重組蛋白的鑒定與分析——6.1Westernblotting將丙酮沉淀后上清→12%聚丙烯酰凝膠電泳→轉移至硝酸纖維膜→1%BSA封閉硝酸纖維膜→依次加入一抗（Aβ42抗體）和二抗（羊抗小鼠HRP標記IgG），TBST洗滌5次，HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色.WesternBlot原理aWesternBlot與Southern

7、印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。WesternBlot原理b經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。WesternBlot原理c以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的

8、蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。WesternBlot操作步驟1、蛋白樣品制備2、蛋白含量的測定3、SDS－PAGE電泳4、轉膜5、免疫反應6、化學發(fā)光，顯影，定影7、凝膠圖象分析6、重組蛋白的鑒定與分析6.2質譜分析從考染（考馬斯亮藍R250CBR-250,用于檢測Pr的氨基和羧基）凝膠上切下重組蛋白帶，進行基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析.7、重