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《畢赤酵母的基因表達(dá)及其初步純化.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、4Aβ15基因在畢赤氏酵母中的分泌表達(dá)及 初步純化——Alade畢赤氏酵母作為表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)1、表達(dá)效率高，遺傳穩(wěn)定性好2、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚3、有Pr加工系統(tǒng)4、培養(yǎng)簡(jiǎn)單，成本低廉5、表達(dá)產(chǎn)物可分泌至培養(yǎng)基中而自身蛋白的分泌卻很少，利于下游的純化（畢赤氏酵母是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)。）一、實(shí)驗(yàn)材料DH5α、pPICZαA、GS115、TOP10、，pQE4Aβ15pMD18T載體、Pfu高保真酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶.PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP、增強(qiáng)型HRP-DAB、底物顯色試劑盒.基因在畢赤氏酵母中表達(dá)
2、的簡(jiǎn)單過(guò)程4Aβ15基因的獲取(PCR)↓目的基因的修飾與克隆↓表達(dá)載體的構(gòu)建↓畢赤氏酵母的線性化、電轉(zhuǎn)化與鑒定↓目的基因在畢赤酵母GS115中的表達(dá)↓重組蛋白的鑒定與分析↓重組4A15的初步純化1、目的基因4Aβ15獲取----PCR在設(shè)計(jì)N端引物時(shí)引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)及Kex2信號(hào)肽水解位點(diǎn)，并刪除Kex2后面的Ste3位點(diǎn)（Glu-Ala-Glu-Ala）在下游引物（5GCTCTAGATTGATGATGAACTTCATA3）引入終止密碼子和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，目的基因4Aβ15獲取----PCR以pQE4Aβ15為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃3min，
3、94℃30s，57℃30s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存.1.5%瓊脂糖分析PCR產(chǎn)物2、目的基因的修飾與克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后+克隆載體pMD18T以1：3（V）的比例通過(guò)T4連接酶接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，菌落PCR。分析陽(yáng)性菌落：挑取4個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行序列分析.序列正確的命名為p4Aβ153、表達(dá)載體的構(gòu)建雙酶切基因片段p4Aβ15，用試劑盒回收，雙酶切質(zhì)質(zhì)粒pPICZaA，回收大片段，定向連接，連接產(chǎn)物在低鹽的LB平板上培養(yǎng)。挑取抗性菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定——5.1電轉(zhuǎn)化1、線
4、性化——限制性內(nèi)切酶BstXI單酶切表達(dá)載體和重組質(zhì)粒2、電轉(zhuǎn)化——電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化條件：電壓1500V，4ms）.電轉(zhuǎn)化完成后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化物涂布于Zeocin100mg/L的YPD平板上，28℃恒溫培養(yǎng)36h左右，抗性平板上生長(zhǎng)的菌落相應(yīng)的命名GS115/pPICZaA和GS115/pPICZa4Aβ15.5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定——5.2轉(zhuǎn)化子的鑒定提取抗性菌落的基因組DNA,(方法參見(jiàn)Invitrogen酵母手冊(cè)).以此基因組DNA為模板，pPICZaA5Aox1primer和3Aox1primer為引物進(jìn)行PCR.1.5%
5、的瓊脂糖凝膠電泳分析6、目的基因在畢赤酵母GS115中表達(dá)挑陽(yáng)性克隆單菌落接種于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素……）的培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)（28℃，250r/min培養(yǎng)至OD600為2~6）離心收集菌體，用BMMY重懸，至OD600≈1繼續(xù)搖床。.每24h向培養(yǎng)基中添加無(wú)水甲醇（誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中）至終濃度為1%；每24h取樣，離心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后進(jìn)行12%SDS-PAGE分析.對(duì)GS115和GS115/pPICZaA作同樣的處理，以便于下游SDSPAGE的分析6、重組蛋白的鑒定與分析——6.1Westernblotting將丙酮沉淀后上清→12
6、%聚丙烯酰凝膠電泳→轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜→1%BSA封閉硝酸纖維膜→依次加入一抗（Aβ42抗體）和二抗（羊抗小鼠HRP標(biāo)記IgG），TBST洗滌5次，HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色.WesternBlot原理aWesternBlot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。WesternBlot原理b經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)
7、活性不變。WesternBlot原理c以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。WesternBlot操作步驟1、蛋白樣品制備2、蛋白含量的測(cè)定3、SDS－PAGE電泳4、轉(zhuǎn)膜5、免疫反應(yīng)6、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影7、凝膠圖象分析6、重組蛋白的鑒定與分析6.2質(zhì)譜分析從考染（考馬斯亮藍(lán)R250CBR-250,用于檢測(cè)Pr的氨基和羧基）凝膠上切下重組蛋白帶，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析.7、重
