《血清蛋白的分離》ppt課件

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1、聚丙烯酰胺凝膠電泳法血清蛋白的分離——(1)學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板及圓盤電泳的操作技術(shù)。目的要求聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N—甲叉雙丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。Acr和Bis單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的,但在具有自由基團體系時就能聚合。引發(fā)自由基團的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種?;瘜W(xué)法的引發(fā)劑是過硫酸胺(Ap),催化劑是四甲基乙二胺(TEMED);光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺,在

2、紫外光照射下引發(fā)自由基團。實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠體系有連續(xù)和不連續(xù)電泳之分。不連續(xù)電泳系統(tǒng)由濃縮膠和分離膠兩種膠體組成,兩種膠體分別由不同的pH的緩沖液和膠貯液配制而成,形成孔徑不同的兩種膠體。不連續(xù)電泳系統(tǒng)電泳分離過程中包括三種物理效應(yīng),即樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)和凝膠的分子篩效應(yīng)。本次試驗采用不連續(xù)電泳系統(tǒng)PAGE,通過三種效應(yīng)將血清中各蛋白質(zhì)組分按其分子大小、電荷多少不同進行分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳有圓盤電泳和垂直板電泳之分,但兩者的原理完全相同,只是所用的電泳槽不同。由于時間問題,本次試驗將分兩組進行,一組使用圓盤,一組使

3、用垂直板。夾心式垂直板電泳槽,圓盤電泳槽,電泳儀,直流穩(wěn)壓電源,玻璃板(13×13),注射器及微量注射器抽氣泵,干燥器,培養(yǎng)皿,玻璃棒,吸量管,燒杯,滴管,玻璃管,薄膜手套,濾紙,日光燈實驗儀器制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑:凝膠緩沖液,分離膠貯存液,0.8%過硫酸銨;濃縮膠緩沖液,濃縮膠貯存液,40%蔗糖溶液,核黃素。Tris-甘氨酸電極緩沖液(PH8.3)已加入溴酚藍指示劑的血清樣品染色液(氨基黑)1%瓊脂(糖)溶液脫色液(7%乙酸溶液)由學(xué)生自己配制實驗試劑一、垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳1.凝膠的制備:(1)安裝夾心式電泳槽將長短玻璃板分別插到U形硅

4、橡框的凹形槽中(注意勿用手接觸灌膠面的玻璃),在長玻璃板下端與硅膠橡框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂糖且兩玻璃板內(nèi)下端處處有瓊脂糖(其目的是封住空隙,凝固后的瓊脂中應(yīng)避免有氣泡),瓊脂凝固后,將硅膠橡框裝入電泳槽內(nèi),以對角線的方式將螺絲帽旋緊。實驗步驟試劑名稱用量(ml)分離膠緩沖液(ph8.9)2.5ml分離膠凝膠貯液5.0ml蒸餾水2.5ml將以上三種試劑混合均勻后,置于真空干燥器中抽氣10min過硫酸銨,置于真空干燥器中,抽氣10min10.0ml(2)分離膠的制備按上表格配膠,二者抽氣后混合均勻,小心不要在溶液中攪出氣泡,以免過多接觸空氣。

5、迅速用滴管將混合后的分離膠裝在二塊玻璃板之間至短板上端約3-4cm,并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠形成時有一水平面,(注意加水時,不要引起膠面的大波動)。在室溫中放置,當(dāng)兩界面出現(xiàn)不同折射率時表明已凝膠,時間大約40分鐘,以出現(xiàn)折射率不同的界面為準,再室溫下放置十分鐘,使凝膠充分。將分離膠上層的水倒去,再用濾紙吸去多余的水(注意不要碰破膠面),為下一步做準備。試劑名稱用量(ml)濃縮膠緩沖液(ph6.7)0.5ml濃縮膠貯液1.0ml40%蔗糖2.0ml將以上三種試劑混合均勻后,置于真空干燥器中,抽氣10min核黃素0.5ml(3)濃縮膠制

6、備:按上表所示配膠,抽氣后加核黃素0.5ml,混勻,立即加入到已配制好的分離膠上面至短玻璃板上端約0.5cm,插入加樣梳,放于日光燈下10分鐘左右濃縮膠就開始凝膠,30~50分鐘左右凝好(凝縮膠變?yōu)槿榘咨珵闇剩?,凝好后小心拔去加樣梳。將Tris—甘氨酸電極緩沖液稀釋10倍后倒入電泳裝置的左、右槽中,短玻板一側(cè)要稍微超過玻板,長玻板一側(cè)只要越過電泳絲的高度。用微量注射器通過緩沖液在每個加樣凹槽中加入約5ul的樣品。2.加樣將樣品端(短玻璃的一邊)接直流穩(wěn)壓電泳儀的負極,接通冷卻水,開始電泳。開始時電流控制在10mA,待樣品進入分離膠時,將電流調(diào)至30m

7、A左右。當(dāng)藍色染料遷移至距離橡膠框下緣瓊脂界面處0.5cm左右時,電泳完成。將緩沖液回收至試劑瓶中,還可用1-2次(注意將正負級的緩沖液分開回收)。3.電泳4.剝膠將固定螺絲旋松,取出硅橡膠框,將一塊玻璃板輕輕剝開,然后用玻璃棒將膠板取下放入培養(yǎng)皿中。5.固定,染色在培養(yǎng)皿中倒入氨基黑染色液至覆蓋膠板,染色分鐘左右,此時染色與固定同時進行。(染色液要回收利用)6.脫色用7%乙酸浸泡數(shù)次,直至背景藍色脫去。1.凝膠的制備:(1)安裝圓形玻管將洗凈的玻璃管烘干后用橡膠玻璃頭封嚴,放置在一邊等待灌膠。二圓盤聚丙酰胺凝膠電泳(2)分離膠制備按垂直板的方案進行

8、配膠,混勻后迅速用滴管分裝在玻璃管中至玻璃管上端約2-3cm,并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠形成時

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